なぜHPLCだけでは不純物の適格性評価に不十分なのか

8月 14, 2026 by Veeprho Team

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、医薬品分析の現場において、力価試験、溶出試験、不純物検出、その他多くの重要な分析に広く利用されている、不可欠かつ重要な分析手法です。HPLCは、簡便で使いやすく、費用対効果に優れ、かつ信頼性の高い手法であり、医薬品分析における精度、一貫性、再現性を確保します。導入以来、絶え間ない技術進歩によってその能力と適用範囲が拡大し、現在では医薬品研究所における主要な分析機器となっています。こうした進歩の例としては、より高い分離能、迅速な分析、溶媒使用量の低減を実現する超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）や、HPLCの発展形として最も広く利用されている手法の一つである液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）などが挙げられます。しかし、こうした利点がある一方で、HPLC単独では不純物の同定・評価（クオリフィケーション）を行うには不十分な点もあり、NMRやLC-MSといった補完的な手法を併用しなければ、不純物の評価を完了させることはできません。本稿では、HPLCの限界と、不純物の評価における他の高度な分析機器の役割に焦点を当てて解説します。

HPLCの限界

HPLCは不純物の分離・定量において重要な役割を果たしますが、いくつかの限界もあります。具体的には、共溶出の問題、構造や質量の特定ができないこと、揮発性不純物の定量範囲が限られること、そしてUV（紫外線）を吸収しない不純物を検出できないことなどが挙げられます。

共溶出の問題

複雑な試料マトリックス中には複数の不純物が存在する可能性があり、それらが同一の保持時間で溶出することで、誤った定量や検出漏れが生じる恐れがあります。

構造情報を特定できないこと

一般的なHPLCで使用されるUV/可視検出器は、保持時間やスペクトルデータに基づいて不純物を検出・定量・同定することはできますが、特定の成分の質量、構造、あるいは組成を決定することはできません。

適用範囲の制限

HPLCは不揮発性有機不純物の分析に最適ですが、揮発性不純物や元素不純物の分析には適していません。これらを定量するには、別途、相補的な手法が必要となります。

特定の化合物に対する不感応性

一部の不純物は発色団を持たず、紫外線を吸収しないため、標準的なHPLCのUV検出器では検出が困難、あるいは事実上不可能となります。

検出感度

規制当局はppb（10億分率）レベルでの試験を求めていますが、標準的なHPLC-UV法ではこのレベルの検出は不可能なため、高度なLC-MS/MS法やGC-MS/MS法が必要とされます。

規制当局の期待

規制当局は広範な……を求めているすべての不純物に関する特性解析データ規制当局への申請に際しては、HPLC単独では得られないデータが求められるようになっています。単にHPLCデータに頼るのではなく、現在では、単離、同定、および特性解析に関する包括的なデータが要求されています。こうした要求に応えるため、HPLCにLC-MS、GC-MS、ICP-MS、NMRを組み合わせた、現代的かつ多角的な分析手法が頻繁に用いられています。具体的には、LC-MSは有機不純物の同定の鍵となる分子量やフラグメンテーションパターンの推定を行い、GC-MSは揮発性不純物を同定し、NMRは詳細な構造情報を提供し、ICP-MSは元素不純物の同定および定量を行います。

LC-MSはHPLCに比べて大きな利点を持つ手法として台頭してきましたが、依然としていくつかの課題が残されており、現時点では不純物定量における完全な解決策とは言えません。主な課題としては、以下のような点が挙げられます。

LC-MSの限界

イオン化の抑制

一部の化合物は完全にはイオン化しないため、質量分析では検出されません。混合物中に薬物や添加剤が高濃度で含まれていると、低濃度で存在する不純物のシグナルが抑制されることがあります。この現象は「イオン抑制」と呼ばれ、UV検出器では検出される不純物であっても、質量分析では検出されなくなります。

移動相の不適合性

HPLC法では不揮発性の緩衝液が頻繁に使用されますが、これらは質量分析計と適合しないため、質量分析に対応した分析法の開発が必要となります。HPLC法を質量分析対応の分析法へ移行することは必ずしも容易ではなく、その過程で溶出順序や分離パターンが変化し、不純物の同定を困難にすることがあります。

ジアステレオマーやエナンチオマーといった立体異性体は、分子式や質量が同一であり、質量分析計において同じピークやフラグメンテーションパターンを示すため、LC-MSのみで識別することは困難です。

分解

場合によっては、質量分析計内でのイオン化の過程で分解が生じることがあります。これにより、分解によって生じた不純物が主要な不純物と誤認され、誤った報告につながる可能性があります。

すべての不純物の同定・確認においてNMRが必須というわけではありませんが、他の手法では対応できない場合には、多くの場合においてNMRが不可欠となります。

薬剤にキラル中心がある場合、質量分析法やHPLCでは単一のピークしか検出されない可能性がありますが、NMRではジアステレオマーを区別できます。このような場合、規制当局はNMRデータを認証文書の一部として要求することがあります。NMRは、参照標準が入手できない場合でも不純物の同定に使用できます。NMRは、不純物のスピン-スピン結合パターンを分析することで未知の化合物を同定します。HPLCでは、不純物の同定と定量に参照標準が必要です。ニトロソアミン原薬関連不純物（NDSRI）, 原薬と構造が類似している不純物について、その構造を確認する手法の一つとしてNMRが挙げられます。LC-MSは質量データを提供できますが、質量は同じでも構造が異なる異性体を識別することはできません。そのような場合、NMRは構造同定に有用なツールとなります。

結論

近年、不純物の適格性評価に対する規制当局の要求は、従来の単純なプロセスから変化しており、包括的なリスク管理や、直交性のある高度な技術を用いた徹底した構造解析・確認が重視されるようになっています。そのため、HPLC単独では不十分であり、NMRやLC-MSといった技術が重要な役割を担っています。

よくある質問

不純物の適格性評価において、なぜHPLCだけでは不十分なのでしょうか？

HPLCでは、不純物の構造や質量を特定することはできません。また、揮発性不純物や元素不純物の分析にHPLCを用いることも不可能です。近年、規制当局はppbレベルでの不純物の定性および定量評価を求めていますが、HPLCではこれに対応できません。そのため、不純物の評価においてHPLCのみでは不十分です。

LC-MSの限界は何ですか？

LC-MSを用いて不純物を検出する際、分子のイオン化が抑制されることは大きな制約となり得ます。選択性の高い移動相はLC-MSにおいてのみ有効です。同一の組成式と質量を持つ異性体の場合、LC-MSではそれらを識別することができません。