液体クロマトグラフィーにおける各種固定相

意味:

HPLC（高速液体クロマトグラフィー）における固定相とは、混合物から化合物を分離するために用いられる、固体または固定化された成分のことです。固定相は、サンプル中の成分と固定相との間の親和性に基づいてサンプル成分と相互作用し、混合物からの成分の保持や溶出を制御する役割を果たします。固定相には、温度の影響を受けないこと、化学的に不活性であること（すなわち、移動相や混合物中の成分と反応しないこと）が求められます。また、固定相の調製に使用される材料は、不揮発性である必要があります。

固定相と移動相は、混合物から成分を分離する上で不可欠な2つの基本要素です。固定相が移動相と相互作用することで、混合物からの成分分離プロセスが促進・強化されます。クロマトグラフィーによる分離を最適化する上で、移動相と固定相は極めて重要です。本記事では、固定相の主な特性について解説・比較を行います。USP（米国薬局方）の一般試験法<621>には50種類以上の固定相が記載されており、このことからも、固定相に関する化学がいかに広範な分野であるかがうかがえます。

一般的なサポート資料

多孔質シリカは、液体クロマトグラフィーにおける固定相の担体として最も一般的に用いられています。固定相の形態には、固体粒子、液体をコーティングした粒子、あるいは化学修飾（ボンテッド）相を形成した担体など、様々なものがあります。固定相の粒子径も、分離や分解能において重要な役割を果たします。粒子径が小さいと、比表面積が大きくなるため分解能や分離能は向上しますが、背圧が上昇する可能性があります。一方、粒子径が大きい場合は背圧を低く抑えられますが、分離能や分解能が低下する恐れがあります。サイズや分子量に基づく分離を行う場合など、特定のケースでは固定相の細孔径も重要となります。また、固定相の表面化学特性も重要な要素であり、その選択は分離対象となる分析種に応じて決定されます。

シリカ系固定相

多孔質シリカは、化学的反応性を持つシラノール基（Si-OH）を有し、高い機械的強度と大きな比表面積を兼ね備えているため、固体支持体として最も広く利用されています。しかし、使用可能なpH範囲は2から9に限られるという制約があります。pHが高い領域ではシラノール基がイオン化し、pHが2未満の領域ではSi-C結合の切断により、結合している誘導体が脱離する可能性があります。

固定相の種類：

固定相には様々な種類があり、その選択は分析対象の分子、そのサイズ、および重量によって決まります。一般的に、主に以下の種類の固定相が使用されています。

1. 逆相固定相：

これはHPLCで最も一般的に使用される固定相です。シリカを非極性基で化学的に修飾したものです。非極性または中程度の極性の化合物が分析され、この固定相を使用することで分離が達成されます。 化合物分離用HPLCカラムの選定, この分類において最も広く使用されているカラムは、オクタデシル炭素鎖（C18）を結合させたシリカ（L1）です。これに続くものとして、C8結合シリカ（L7）、純シリカ（L3）、シアノ基結合シリカ（CN）（L10）、極性基埋め込み型（アミド）、フッ素化フェニル基およびフェニル基結合シリカ（L11）が挙げられます。

一般的な逆相化学特性

逆相クロマトグラフィーで検討可能な逆相固定相には、オクタデシルシラン、オクチルシラン、フェニル、シアノなどがあります。オクタデシルシラン（C18）は18個の炭素原子を持ち、一方、オクチルシラン（C8）はシリカ（Si）に結合した炭素原子を8個しか持ちません。C18はC8よりも化合物を強く保持します。フェニルカラムには強いπ-π相互作用が存在し、他の逆相カラムとは異なる特別な選択性を示すことがあります。

フェニルカラムは、芳香環を持つ化合物の分析や分離に最も適したカラムです。シアノカラムでは、ジイソプロピルシアノプロピル基が主な固定相となります。強い双極子相互作用によって極性分子が引き寄せられ分離されるため、逆相モードと順相モードのいずれでも有用です。

用途と利点

医薬品、バイオ、環境分野の分析対象となる化合物の多くは、極性を持ち、水溶性です。そのため、水系移動相との適合性が高い逆相（リバースフェーズ）が、これらの化合物の分析において好ましい固定相として採用されています。逆相クロマトグラフィーは、中程度の極性を持つ化合物から無極性化合物、さらにはペプチド、タンパク質、天然物に至るまで、幅広い用途に対応しています。また、逆相は安定性と再現性に優れているとされています。さらに、有害性の低い溶媒を使用するため環境に優しく、規制当局からも広く受け入れられています。

2. 順相固定相：

これは選択的分離に用いられる固定相であり、シリカまたは修飾シリカから構成されています。順相クロマトグラフィーにおいて、固定相は極性を有します。順相クロマトグラフィーで最も一般的に使用される固定相は、(a) シリカやアルミナなどの無機吸着剤、あるいは (b) シリカゲル担体にアミノプロピル基、シアノプロピル基、ニトロフェニル基、ジオール基などの官能基を化学的に結合させた、中程度の極性を持つ化学結合型固定相のいずれかです。

キラル固定相 (CSPs)

キラル固定相（CSP）は、鏡像異性体（互いに重ね合わせることのできない鏡像関係にある分子）を分離するために、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で使用される特殊な材料です。市場には様々な種類のキラル固定相が流通しています。

これらのキラル固定相は、その構成要素であるキラルセレクター（キラル識別部位）の種類に基づいて分類されます。したがって、キラル化合物の分析や分離において、これらの固定相は極めて重要な役割を果たします。一般的な分類の一つとして、タンパク質系CSPが挙げられます。これらは、アルブミンやグロブリンといった天然タンパク質を固定相として利用するもので、鏡像異性体混合物の分離に用いられます。こうしたCSPは、低分子有機化合物を含む幅広いキラル化合物の分離に頻繁に使用されています。

その他の順相アプリケーション

アミノ系固定相は、糖類、アミノ酸、および極性分子の分離に使用されます。シアノ系固定相も、中程度の極性を持つ分子の分離に利用可能です。セルロースを固定相とするキラルカラムは、キラル分子の鏡像異性体の分離に用いられます。キラルセレクターとしてアミロースを利用するキラル固定相もあります。また、タンパク質をベースとしたキラル固定相も存在します。

3. イオン交換クロマトグラフィー

イオン交換クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーの一種としても用いられます。このクロマトグラフィーの固定相はスチレン-ジビニルベンゼンから構成されており、標的分子を引き寄せたり反発させたりする荷電基を有しています。アニオン交換体は表面に正電荷を帯びた部位を持ち、スルホン酸基、リン酸基、またはカルボキシレート基の分離に使用されます。一方、カチオン交換体は表面に負電荷を帯びた部位を持ち、アミンなどの塩基性物質の分離に使用されます。この固定相は、タンパク質、核酸、およびその他の荷電した生体分子の分離に利用されています。

イオン交換では、陰イオン交換または陽イオン交換を用いて、負または正に帯電した化合物を分離します。

4. サイズ排除クロマトグラフィー

サイズ排除クロマトグラフィーは、ゲル浸透クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの2つに大別され、分子のサイズや形状に基づいて分子を分離します。使用される固定相は多孔質のポリマーマトリックスであり、その細孔内は移動相として用いられる溶媒で満たされています。この固定相は多孔質のポリマーマトリックスで構成されているため、小さな分子のみが細孔内に入り込み、大きな分子は排除されます。その結果、大きな分子が先に溶出し、続いて小さな分子が溶出することになります。この固定相は、タンパク質や多糖類のような大きな分子の分離に用いられます。

結論：

以上のことから、HPLCを用いた分析において、固定相が極めて重要な要素の一つであることが理解できます。適切な種類の固定相を選択することで、分離を容易に最適化することが可能です。他のパラメータと組み合わせて適切な固定相を選定すれば、クロマトグラフィーのプロセスを最適化し、時間の節約を図るとともに、より正確で再現性の高いデータを得ることができます。逆相、順相、イオン交換、サイズ排除といった各クロマトグラフィーの基本的な違いを理解していれば、分析対象化合物の化学的性質に基づいた適切な判断を下すことができます。キラル固定相を用いた鏡像異性体の分離、イオン交換による荷電生体分子の分析、あるいはサイズ排除による分子量分布の測定など、どのような分析であっても、固定相の選択が分離の成否を左右します。新たな結合化学やカラム技術の導入によりクロマトグラフィーが進化し続ける中、最適な分析結果を得るためには、こうした基本原理を習得しておくことが依然として不可欠です。

よくある質問

Reference:

• Kaliszan, R. “Quantitative Structure Property (Retention) Relationships in Liquid Chromatography.” Liquid Chromatography, Elsevier, 2013, pp. 385–405, https://doi.org/10.1016/b978-0-12-415807-8.00017-1.
• ‌Mathew, Ceema, et al. “Stationary Phases Used in LC: A Detailed Review.” International Journal of Research Publication and Reviews Journal Homepage: Www.ijrpr.com, no. 6, 2025, pp. 1175–83, ijrpr.com/uploads/V6ISSUE7/IJRPR50170.pdf.