向流クロマトグラフィー
「向流クロマトグラフィー」という用語は、実際には2つの液相が逆方向に流れるわけではないため、やや誤解を招く可能性がある。CCCは、固体支持体を必要としない液体固定相を特徴とする液体クロマトグラフィー技術である。
CCC（向流クロマトグラフィー）の起源
この技術は伊藤洋一郎氏によって開発され、クレイグの向流分割法, これも、二つの液相間の分配による溶質の分離を伴う。「サポートフリー液体クロマトグラフィー」のような別名も考えられるものの、既存の用語とCCCという略称は文献で広く採用されており、関連する研究が膨大であるため、変更は現実的ではない。
CCCにおける重要な課題は、支持体を必要としない液体固定相を安定に維持することです。従来の液体クロマトグラフィーでは、カラムは両端にフリットを取り付けたチューブで構成されていることが多いですが、現代のCCC「カラム」は、液体移動相がカラム内を移動する際に、遠心力を利用して液体固定相を安定化させます。この遠心力への依存により、ローター、ギア、スプール、回転シール、モーター、速度調整器などの回転部品が必要になります。最終的に、, CCC 装置全体がクロマトグラフィーカラムとして機能します。
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サポートなしの液体固定相の利点
柔軟性
CCCでは、どちらの相も移動相として使用できます。さらに、注入したサンプルの成分がカラム内に長時間留まる場合は、分析中に移動相を変更することも可能です。水とオクタン-1-オール、ヘプタン、クロロホルムなど、少なくとも2種類の混和しない溶媒が必要です。有機溶媒分離によく使用される相分離システムでは、3種類、4種類、あるいはそれ以上の溶媒が使用されることもあります。相図を利用することで、特定のアプリケーションに最適な二相液体システムを設計することができます。
CCCの独特な機会
液体固定相を利用する際の最大の制約は、その液体としての性質です。固体固定相はカラム内に容易に封じ込めることができますが、同じく液体である移動相を導入すると、液体固定相の安定性を維持することが困難になります。クレイグ装置と基本的な液滴CCC装置は、この目的のために地球の重力場を利用していました。しかし、この低い重力のために移動相の流速を遅くする必要があり、実験が数日間にわたることがありました。
回転部品を備えた新しいCCCカラム
この問題を解決するために、より強力な遠心力場が必要となり、ローターやギアなどの回転部品を備えた最新のCCCカラムの設計が促進されました。これらの革新により、移動相の流れに対して液体固定相の大部分を効果的に安定化できる、堅牢で効率的な遠心力場を作り出すことが可能になりました。
二相液体システムでは、幅広い溶媒の組み合わせが利用可能であり、柔軟性は高いものの、適切な組み合わせの選択には時間がかかるなど、課題も生じます。特にプロセスに不慣れな場合はなおさらです。一方の液相の組成に何らかの変化が生じると、もう一方の液相にも影響が及ぶ可能性があり、従来の液体クロマトグラフィーと比較してCCCのグラジエント溶出が複雑になる可能性があることに留意することが重要です。
動的相混合
向流クロマトグラフィー (CCC) では、分離された成分の固定相へのアクセス性は、液体内の拡散プロセスと相混合の有効性によって影響を受けます。相混合の有効性は、カラムの設計仕様、動作流体力学的条件、および 2 相液体システムの物理化学的特性によって決まります。
CCCは、クロマトグラフィープロセス全体を通して二相液体システムの動的な相混合を独自の方法で促進します。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）では、固定相の基本材料としてシリカが使用されるため、移動相のpHは2～8の範囲に制限されます。酸性移動相は有機結合部位の切断を引き起こす可能性があり、塩基性移動相はシリカを溶解する可能性があります。しかし、現代の高価なHPLC固定相は、pH 1および/またはpH 10の移動相でも効果的に機能します。逆に、二相液体システムを作成するために使用される溶媒がpHに敏感でない場合は、CCCカラムで最も一般的に使用される材料はテフロンであるため、pHに関連する追加の問題は発生しません。
溶質と固定相との強い相互作用は、HPLCにおける生物学的試料に悪影響を及ぼす可能性がある。対照的に、CCCは溶質の保持に液液分配のみに依存しており, 分子に優しく、その生物学的活性を維持するのに役立ちます。
溶質は固定相の大きな体積を利用できる
CCCは間違いなく効果的な分取分離技術であり、固定相の液体性によって充填率が向上するという大きな利点があります。導入された物質は固定相の全容積内に完全に溶解します。さらに、液液吸着等温線は、液固吸着等温線に比べて直線範囲が広くなります。
固定相過負荷の問題はCCCではそれほど顕著ではない。従来のHPLC, これは主に、固定相の容積がカラム総容積の最大90%を占めるほど大きいことに起因します。CCCのこの特性は、分析化学、特に標準物質の調製に利用する場合、有益となる可能性があります。
CCC 列
液相を固定するために用いられる様々なカラム設計のうち、商業化に向けた継続的な開発が期待されるのはわずか2つだけです。これらは、静水圧構成と流体力学的構成と呼ばれます。
静水圧CCCカラム
初期の静水圧向流クロマトグラフィー（CCC）カラムは、重力を利用して液体の固定相を所定の位置に保持し、液滴CCC（DCCC）カラムと呼ばれていました。これらのカラムは、しばしば数日間に及ぶ長い溶出時間を必要としたため、現在では時代遅れとなっています。現代の静水圧CCCカラムは、遠心分離分配クロマトグラフ（CPC）として認識され、販売されています。主な特徴は、(1) 均一な遠心場を作り出す単一の回転軸、(2) チューブ、チャネル、または小室などの幾何学的体積が接続チューブを介して相互接続され、特定のパターンを形成することです。図1A
図1：CCCカラム内の液体の動きを模式的に表しています。図1A – 静水圧カラムまたは連続相カラム（CPC）は、単一の回転軸を備えており、一定の遠心力場（G）を発生させます。接続ダクト内では相間相互作用は発生しません。図1B – 流体力学カラムは、ボビンが自身の軸と中央ローター軸の周りを遊星回転することで、変動する周期的な遠心力場（G）を発生させます。チューブ全体にわたって、2つの液相間の相互作用が発生しており、移動相は黒、固定相は白で示されています。
溶質相互作用の接触時間を最小限に抑える
注目すべきは、移動相のみを収容する接続ダクトが相当量あることです。この構成により、溶質と固定相の接触時間が最小限に抑えられ、小さな静水圧が生成されます。これにより、静水圧遠心分離機の運転に必要な大きな圧力降下が抑えられます。
すべての静水圧遠心分離機には、上部と下部にそれぞれ1つずつ、計2つの回転シールが装備されており、静かに動作します。遠心力下で動作するトロイダルコイルCCC（ヘリックスCCC）システムでは、コイルの寸法が分析分離のために最適化されています。コイルは遠心ボウルの外縁に沿って配置されており、安定した放射状に作用する遠心力場によってコイルの片側で固定相を維持します。これは、前述の基本的な静水圧システムと同様です。
流体力学的CCCカラム
CCCカラムに用いられる流体遠心分離機は、主軸と可変遠心力場を形成する遊星軸の2つの回転軸を備えています。複数の遊星軸も使用できますが、最も一般的な構成は単軸、二軸、三軸です。各遊星軸には、連続的に巻かれたテフロンチューブのコイルを収容するボビンまたはスプールが備えられています。
流体力学の柱では、スプール半径の比, rとローター半径Rの比は非常に重要です。この比は歴史的にβと呼ばれてきました。液体クロマトグラフィーでは、βはVS/VMの相比として定義され、CCCのβ比はβr = r/Rと表されます。図2
高速CCC
チューブは遠心分離機の外部に接続し、ボビンに巻き付けて、回転シールを必要とせずに外部に戻すことができるため、クロマトグラフィーの観点からは実質的に単一の細長い連続カラムとして機能します。可変力場は、添付の図1Bに示すように、コイル状カラムの全長にわたって混合ゾーンと沈殿ゾーンを形成します。2つの液相間の連続的な相互作用は、カラム全体にわたって大きな圧力蓄積なしに発生します。流体遠心分離機は低い移動相圧力で動作しますが、ギアアセンブリからノイズが発生する場合がありますが、これは適切に設計することで最小限に抑えることができます。これらのカラムは、しばしば「流体遠心分離機」と呼ばれます。高速CCC (HSCCC) カラムは、クレイグ、DCCC、重力駆動カラムに比べてはるかに高速で動作できるため、特に人気があります。
図 2 : 遊星歯車システムを備えた流体 CCC 機器内の回転コイルの概略図を示します。
2種類のCCCカラムの特性の比較を表1に示します。どちらか一方が他方より優れていると断言することは現実的ではありません。最適なアプローチは、両方の種類のCCCカラムを活用して幅広いシナリオに対応することです。現在進行中の研究では、大量の精製物質（分取用CCC）を製造できる大規模CCC遠心分離機の開発を目指しています。このような遠心分離機は、分析用途の標準物質の製造や分析試薬の精製を目的としています。
流体力学的柱と静水力学的柱の特性の比較
| カラム | 流体力学 | 静水圧 |
| 液体が保持される | コイル状のテフロンチューブ | チャンネル |
| 商号および略称 | コイルプラネット遠心分離機、高速向流クロマトグラフ、HSCCC | 遠心分離クロマトグラフ、CPC |
| 遠心力場 | 可変、2つの回転軸 | 一定、1つの回転軸 |
| 固定相保持 | 変数 | 良い |
| 効率 | チューブ1回転あたり最大4枚のプレート | チャネルごとに最大1枚のプレート |
| プレッシャー | 低、0.1～10 kg/cm2 | 中型、2～70 kg/cm2 |
| メンテナンス | 約100時間ごとに交換する接続チューブ | 約100時間ごとに回転シールで潤滑 |
| 他の | 騒音の出るギアアセンブリの可能性、ベルト駆動の静かな遠心分離機 | 静かな遠心分離機 |
クロスアクシスクロマトグラフは、2つのコイルドチューブスプールを備えた流体力学的向流クロマトグラフィー（CCC）カラムです。これらのスプールはローター内に配置され、回転軸は主回転軸に対して垂直に配置されています。
CCCカラム内の液体の動き
静水圧CCCカラムまたはCPC
図1に示すように、2種類のCCCカラムにおける液体の挙動には大きな違いがあります。液体の固定相が静水圧カラムのチャネル内に物理的に保持されることは比較的容易に理解できます。移動相の流速が停止すると、両方の液相はそれぞれの位置に留まります。これが「静水圧」という用語が使われている理由です。固定相を通過する移動相の動きは、それらの相対密度の影響を受けます。
図1Aでは、黒い移動相は軽い液体（試験管内の上相）を表しています。移動相は下端から流路に入り、上端から排出されます。このプロセスは上昇モードと呼ばれ、移動相は保持されたより密度の高い固定相を通過して上昇します。
逆に、より密度の高い液相を移動相として使用する場合、液相はチャネルの上部から流入し、下部から流出します。これは下降モードと呼ばれ、密度の高い移動相が、保持されているより軽い固定相を通過して下降します。図1Aでは、移動相が液滴に細分化している様子が示されています。実際には、移動相は固定相を通過し、コリオリの力によって回転方向に曲がりながらカスケード状に流れ、チャンバー壁または液相界面に衝突して混合スプレーまたは液滴を生成します。
流体力学的CCCカラムまたはHSCCC
最近まで、流体力学カラム内の液体固定相の保持の背後にあるメカニズムは完全には解明されていませんでした。
コイル状のチューブを備えた回転ボビンまたはスプールを使用するシステムでは、らせん構造によってアルキメデスのねじ力と呼ばれる力が生成され、含まれる液体がチューブの一端（ヘッドと呼ばれる、圧力がより高くなる部分）に向かって推進されます。
逆に、反対側の端は「尾部」と呼ばれ、圧力が低いという特徴があります。回転するコイル状の管またはカラムに混ざらない2種類の液体を導入すると、密度の高い液体が尾部に向かって移動し、それによって軽い液体が頭部に向かって押し出されます。アルキメデスのねじの力の大きさと方向は、回転速度、およびコイル状の管の方向と螺旋ピッチによって影響を受けます。
流体力学的CCCの仕組み?
図1Bに示すように、軽い黒色の液相が回転コイルの末端から導入されると、一連の混合・沈殿ゾーンを経て、密度の高い液体中を通り、頭部に到達します。軽い相は、密度の高い相を通過して末端から頭部へと進みます。密度の高い相を移動相として使用する場合は、CCCカラムの末端から導入し、軽い相を通過しながら、頭部から尾部へと移動させます。ローターの回転が継続している間に移動相の流速が停止すると、アルキメデスのねじれ力によって、軽い液相はコイルの先端に向かって、重い液相は尾部に向かって移動します。
この相の明確な動きは、このプロセスを流体力学的に特徴づけます。固定相は移動相の流れに対して平衡状態を保ちます。移動相の流れが増加すると、固定相のカラムからの置換量が増加し、保持される固定相の量が減少します。
クロマトグラフィーにおける溶媒システム
3 つの主な基準
多様な極性や抽出剤の添加を特徴とする様々な二相溶媒系は、有機化合物、生体有機化合物、および無機化合物の分離に利用できます。このようなシステムでは、水相または有機相のいずれかが移動相として機能します。
一般的に、分取向流クロマトグラフィー（CCC）用に確立された溶媒系は、分析目的にも適応できます。無機分離に使用される溶媒系は、有機分離に使用されるものとは大きく異なることに注意することが重要です。無機分離には通常、錯化剤または抽出剤（リガンド）が含まれるためです。
2 相液体システムを選択するときは、次の 3 つの主な基準を考慮する必要があります。
- まず、システムは混ざり合わない 2 つの相を生成する必要があります。
- 次に、選択した固定相を CCC カラム内に保持する必要があります。
- 最後に、選択された 2 相液体システムは、サンプルの分離を効果的に促進する必要があります。
混ざり合わない二つの相
多くの溶媒混合物は、混ざり合わない二つの相を形成する可能性があります。分離対象となる有機物質の特性を理解していれば、類似の化合物に効果的に利用されている溶媒系に関する既存の文献を参照することで、適切な溶媒系を特定することができます。
有機-水二相系において、有機相は単一の溶媒または複数の溶媒の組み合わせで構成される場合があります。ヘプタン/アセトニトリルなどの様々な非水/非水溶媒系は、非極性化合物や水環境で不安定な化合物の分離に用いられてきました。
高分子と細胞粒子の分離は、様々な水性/水性ポリマー相システムを用いて行うことができます。利用可能なポリマー相システムの中で、特に向流クロマトグラフィー（CCC）に汎用性の高い2つのタイプが際立っています。ポリエチレンオキシド（PEO）/リン酸カリウムシステムは、選択したPEOの分子量、および/またはリン酸緩衝液のpHや濃度を変更することで、高分子の分配係数を調整できます。PEO 6000/デキストラン 500システムは、電解質の添加により浸透圧とpHを最適化することで、哺乳類細胞の分離に適した生理学的環境を作り出します。
液体固定相の顕著な保持
液体固定相の効果的な保持に寄与する要因は、CCCカラムの特性、例えばコイルに使用されるチューブ径、コイルサイズ、β比（図3参照）によって左右されます。さらに、回転速度や移動相の流量といった実験条件も重要な役割を果たします。二相液体システムの物理化学的特性も、液体固定相の最適な保持を確保する上で極めて重要です。
重要なパラメータには、液相間の密度差、移動相の粘度、界面張力などがあり、これらはすべてSF比に大きな影響を与えます。例えば、PEO、リン酸カリウム、水からなる水性二相系（ATPS）は、界面張力が低く、PEO上相の粘度が高く、密度差が小さいため、流体力学的カラムでは扱いが困難です。しかし、ATPSは静水力学的カラムでは効果的に利用できます。
さらに、特に無機分離の場合、抽出剤とミネラル塩を 2 相システムに組み込むと、液体システムの物理化学的特性に大きな影響を与え、それによって流体力学的挙動と固定相の保持値に影響を及ぼす可能性があります。
固定相の液体性質を利用する独自の方法
以下は、向流クロマトグラフィー（CCC）における固定相の液体特性を利用した3つの異なる応用例です。いずれの場合も、溶質が固定相に過剰に保持されるという問題に対処するために手法が考案されました。これらのクロマトグラフィー分離技術は、固体固定相を用いる他の方法では実現不可能です。
デュアルモード方式
デュアルモード向流クロマトグラフィー（CCC）では、分離プロセスにおいて移動相と固定相を分析中に切り替えます。この切り替えにより、カラムに送液する相と流向の両方を変更する必要があります。この切り替えにより溶出順序が乱れる可能性がありますが、通常はサンプル全体をカラムから溶出させるのに効果的です。デュアルモードCCCアプローチでは、分離中に移動相を変更できるため、最初の固定相に対して高い親和性を持つ化合物にメリットがあります。この方法は、固定相と移動相の両方の液体特性を活用することで、分離を向上させます。
同時 CCC
同時向流クロマトグラフィー（CCC）は、カラムに強く保持された溶質の溶出を促進する代替アプローチです。この技術では2つのポンプを用い、液体の固定相を移動相と同じ方向に徐々に押し進めます。通常、固定相の流量は移動相の流量の1%未満に維持されます。この方法は、水系移動相とゆっくりと移動するオクタン-1-オール固定相を用いて、水中のオクタン-1-オールの分配定数を決定する際に効果的に利用されています。
溶出押し出し法
液体固定相に対して強い親和性を示す溶質を回収する別の方法として、遠心分離機の運転停止後、カラム容量分の溶出を行った後、カラム内容物全体を押し出す方法があります。研究によると、バンドの広がりの大部分は、溶質が移動相とともにカラムから排出される際に発生します。カラム内では、2つの液相が相互作用するため、ピークは狭いままです。2つの液相をカラムから押し出すことで、狭いピークが保持され、予想外に高いピーク分離係数が得られます。
