역류크로마토그래피
“역류 크로마토그래피”라는 용어는 두 액체상이 실제로 반대 방향으로 흐르지 않기 때문에 다소 오해의 소지가 있다고 주장할 수 있습니다. 역류 크로마토그래피는 고체 지지체가 필요 없는 액체 고정상을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피 기술입니다.
CCC(Counter Current Chromatography)의 기원
이 기술은 Yoichiro Ito가 개발했으며, 이를 참고하여 명명했습니다. 크레이그의 역류분할법, 여기에는 두 액상 사이의 분배를 통한 용질 분리도 포함됩니다. 지지체 없는 액체 크로마토그래피와 같은 대체 명칭의 가능성에도 불구하고, 기존 용어와 CCC 약어가 문헌에서 널리 채택되어 관련 연구가 방대하기 때문에 어떤 변경도 비현실적입니다.
CCC에서 중요한 과제는 지지체가 없는 안정적인 액체 고정상을 유지하는 것입니다. 컬럼이 양쪽 끝에 프릿이 있는 튜브로만 구성되는 기존 액체 크로마토그래피와 달리, 최신 CCC “컬럼”은 액체 이동상이 액체 고정상을 통과하는 동안 원심력을 이용하여 액체 고정상을 안정화합니다. 이러한 원심력 의존성으로 인해 로터, 기어, 스풀, 회전 씰, 모터, 속도 조절기 등 회전 부품의 사용이 필수적입니다. 궁극적으로, CCC 장치 전체가 크로마토그래피 컬럼 역할을 합니다.
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지지체 없는 액체 고정상의 이점
유연성
CCC에서는 두 상 모두 이동상으로 작용할 수 있습니다. 또한, 주입된 시료 성분이 컬럼에 장시간 머무르는 경우, 분석 도중 이동상을 변경할 수 있습니다. 물과 옥탄-1-올, 헵탄 또는 클로로포름을 혼합한 것과 같이 최소 두 가지의 서로 섞이지 않는 용매가 필요합니다. 유기 분리를 위한 일반적인 상 시스템은 세 가지, 네 가지, 또는 그 이상의 용매를 포함할 수 있습니다. 상도를 활용하면 작업자가 특정 용도에 가장 적합한 이상성 액체 시스템을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.
CCC의 독특한 기회
액체 고정상을 사용하는 데 있어 가장 큰 한계는 액체라는 본질적인 특성입니다. 고체 고정상은 컬럼 안에 쉽게 담을 수 있지만, 액체 형태의 이동상을 도입하면 액체 고정상의 안정성을 유지하는 것이 어려워집니다. 크레이그 머신과 기본적인 액적 CCC 장치는 이러한 목적을 위해 지구의 중력장에 의존했습니다. 그러나 이러한 낮은 중력은 이동상 유속을 느리게 해야 했고, 이로 인해 실험은 며칠에 걸쳐 진행될 수 있었습니다.
회전 구성 요소가 있는 새로운 CCC 컬럼
이 문제를 해결하기 위해 더 강력한 원심장이 필요했고, 이로 인해 로터와 기어와 같은 회전 부품을 갖춘 최신 CCC 컬럼이 설계되었습니다. 이러한 혁신을 통해 상당량의 액체 고정상을 이동상 흐름에 대해 효과적으로 안정화할 수 있는 견고하고 효율적인 원심장을 구축할 수 있었습니다.
이상성 액체 시스템에 사용할 수 있는 용매 조합의 범위가 매우 넓어 유연성이 뛰어나지만, 적절한 조합을 선택하는 데 시간이 많이 소요될 수 있다는 어려움이 있을 수 있습니다. 특히 이 공정에 익숙하지 않은 사람들에게는 더욱 그렇습니다. 한 액상의 조성 변화가 다른 액상에 영향을 미쳐 기존 액체 크로마토그래피에 비해 CCC의 기울기 용출이 더 복잡해질 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.
동적 위상 혼합
역류 크로마토그래피(CCC)에서 분리된 성분의 고정상 접근성은 액체 내 확산 과정과 상 혼합의 효과에 영향을 받는데, 이는 컬럼의 설계 사양, 작동 유체 역학 조건 및 2상 액체 시스템의 물리화학적 특성에 의해 결정됩니다.
CCC는 크로마토그래피 공정 전반에 걸쳐 2상 액체계의 동적 상 혼합을 독특하게 촉진합니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 고정상의 기본 물질로 실리카를 사용하면 이동상의 pH가 2~8로 제한됩니다. 산성 이동상은 유기 결합 부분의 절단을 유발할 수 있고, 염기성 이동상은 실리카를 용해시킬 수 있습니다. 그러나 최신 고가 HPLC 고정상은 pH 1 및/또는 pH 10의 이동상에서도 효과적으로 작동할 수 있습니다. 반대로, 2상 액체계를 만드는 데 사용되는 용매가 pH에 민감하지 않은 경우, 테플론이 CCC 컬럼에 가장 일반적으로 사용되는 소재이므로 추가적인 pH 관련 문제가 발생하지 않습니다.
용질과 고정상 사이의 강한 상호작용은 HPLC에서 생물학적 물질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 반대로, CCC는 용질 유지를 위해 액체-액체 분할에만 의존합니다. 분자에 부담을 주지 않고 생물학적 활동을 유지하는 데 도움이 됩니다.
용질은 고정상의 상당한 부피를 활용할 수 있습니다.
CCC는 의심할 여지 없이 효과적인 분취 분리 기술이며, 고정상의 액체 특성으로 인해 적재성이 향상된다는 상당한 이점을 제공합니다. 도입된 물질은 고정상의 전체 부피 내에서 완전히 용해될 수 있습니다. 또한, 액체-액체 흡착 등온선은 액체-고체 등온선에 비해 더 넓은 선형 범위를 나타냅니다.
CCC에서는 정상상 과부하 문제가 덜 두드러집니다. 기존 HPLC, 주로 고정상의 부피가 상당히 크기 때문에 전체 컬럼 부피의 최대 90%를 차지할 수 있습니다. CCC의 이러한 특징은 분석 화학, 특히 표준 물질 제조에 활용될 때 유용할 수 있습니다.
CCC 컬럼
정지된 액상을 유지하기 위해 사용되는 다양한 컬럼 설계 중, 지속적인 상업적 발전에 유망한 것으로 나타난 것은 두 가지뿐입니다. 바로 정수압식과 유체역학식입니다.
정수압 CCC 컬럼
초기 정수압 역류 크로마토그래피(CCC) 컬럼은 중력을 이용하여 액체 고정상을 제자리에 고정했으며, 이를 액적 CCC(DCCC) 컬럼이라고 불렀습니다. 이 컬럼은 용출 시간이 길어, 종종 며칠에 걸쳐 진행되었기 때문에 현재는 사용되지 않습니다. 현대 정수압 CCC 컬럼은 원심분리 크로마토그래피(CPC)로 인식되어 판매되고 있습니다. CCC 컬럼의 주요 특징은 다음과 같습니다. (1) 일정한 원심장을 생성하는 단일 회전축, (2) 연결 튜브를 통해 서로 연결되어 특정 패턴을 형성하는 튜브, 채널 또는 로큘과 같은 기하학적 부피의 존재. 그림 1A
그림 1: CCC 컬럼 내 액체 이동의 개략도를 보여줍니다. 그림 1A – 정수압 컬럼 또는 연속상 컬럼(CPC)은 단일 회전축을 가지며, 이 회전축은 일정한 원심력(G)을 생성하고, 연결 덕트에서는 상간 상호 작용이 발생하지 않습니다. 그림 1B – 유체역학 컬럼은 보빈이 자체 축과 중앙 로터 축을 중심으로 행성처럼 회전하여 가변적이고 순환적인 원심력(G)을 생성합니다. 튜빙 전체에서 두 액체상 사이에 상호 작용이 발생하며, 이동상은 검은색으로, 고정상은 흰색으로 표시됩니다.
용질 상호작용을 위한 접촉 시간 최소화
특히, 이동상만을 포함하는 연결 덕트의 용량이 상당히 큽니다. 이러한 구성은 용질이 고정상과 상호작용하는 데 걸리는 접촉 시간을 최소화하고, 낮은 정수압을 발생시켜 정수압 원심분리기 작동에 필요한 상당한 압력 강하를 설명합니다.
모든 정수압 원심분리기에는 상단과 하단에 각각 하나씩, 총 두 개의 회전 씰이 장착되어 있으며, 조용하게 작동합니다. 원심력에 의해 작동하는 토로이드형 코일 CCC(나선형 CCC) 시스템에서 코일의 크기는 분석 분리에 최적화되어 있습니다. 코일은 원심 분리기 용기의 바깥쪽 가장자리에 위치하여, 안정적으로 방사형으로 작용하는 원심력장이 코일 한쪽의 정상 상태를 유지하도록 합니다. 이는 앞서 설명한 기본 정수압 시스템과 유사합니다.
유체역학 CCC 컬럼
CCC 컬럼에 사용되는 유체역학적 원심분리기는 두 개의 회전축, 즉 주축과 가변적인 원심력장을 생성하는 유성축을 갖습니다. 여러 개의 유성축을 사용할 수 있지만, 가장 널리 사용되는 구성은 단일축, 이중축, 삼중축입니다. 각 유성축에는 연속적으로 감긴 테플론 튜빙 코일을 수용하는 보빈 또는 스풀이 장착되어 있습니다.
유체역학 컬럼에서 이해 스풀 반경의 비율, 회전자 반경 R에 대한 r의 비율은 매우 중요합니다. 이 비율은 역사적으로 β로 불려 왔습니다. 액체 크로마토그래피에서 β는 상 비율 VS/VM으로 정의되며, CCC 베타 비율은 βr = r/R로 표현됩니다. 그림 2
고속 CCC
튜빙은 원심분리기 외부에 연결하여 보빈에 감은 후 회전 씰 없이 외부로 다시 돌려보낼 수 있어 크로마토그래피 관점에서 볼 때 길고 얇은 단일 연속 컬럼처럼 효과적으로 작동합니다. 가변적인 힘장은 그림 1B에서 볼 수 있듯이 코일 컬럼 전체 길이에 걸쳐 혼합 및 침전 영역을 용이하게 합니다. 두 액상 간의 연속적인 상호작용은 상당한 압력 축적 없이 컬럼 전체에서 발생합니다. 유체역학 원심분리기는 낮은 이동상 압력에서 작동하지만, 기어 어셈블리에서 소음이 발생할 수 있으며, 이는 잘 설계된 설계를 통해 최소화할 수 있습니다. 이러한 컬럼은 종종 고속 CCC (HSCCC) 컬럼은 Craig, DCCC 및 중력 구동 컬럼에 비해 훨씬 더 빠른 속도로 작동할 수 있는 능력으로 인해 우수합니다.
그림 2: 행성 기어 시스템을 갖춘 유체 역학 CCC 기기 내의 회전 코일을 개략적으로 나타낸 것입니다.
두 가지 유형의 CCC 컬럼의 특징을 비교한 결과가 표 1에 제시되어 있습니다. 어느 한 유형이 다른 유형보다 확실히 우수하다고 단정 지을 수는 없습니다. 최적의 접근 방식은 다양한 상황에 대처하기 위해 두 가지 유형의 CCC 컬럼을 모두 활용하는 것입니다. 현재 진행 중인 연구는 상당량의 정제된 물질(분취용 CCC)을 생산할 수 있는 대규모 CCC 원심분리기 개발을 목표로 합니다. 이러한 원심분리기는 분석 응용 분야의 표준 표준 물질 생산 및 분석 시약 정제에 사용됩니다.
유체역학 및 정수압 컬럼의 특성 비교
| 열 | 유체역학 | 정수압 |
| 액체가 보관됨 | 코일형 테프론 튜브 | 채널 |
| 상호 및 약어 | 코일 플래닛 원심분리기, 고속 역류 크로마토그래피, HSCCC | 원심분배크로마토그래피, CPC |
| 원심장 | 변수, 두 개의 회전축 | 상수, 회전축 하나 |
| 정지상 유지 | 변하기 쉬운 | 좋은 |
| 능률 | 튜브 회전당 최대 4개의 플레이트 | 채널당 최대 1개의 플레이트 |
| 압력 | 낮음, 0.1-10 kg/cm2 | 중간, 2-70 kg/cm2 |
| 유지 | ~100시간마다 교체할 연결 튜빙 | ~100시간마다 윤활을 위한 회전 씰 |
| 다른 | 벨트 구동 방식의 더 조용한 원심분리기, 시끄러운 기어 조립이 가능합니다. | 조용한 원심분리기 |
교차축 크로마토그래피는 두 개의 코일형 튜빙 스풀을 갖춘 유체역학적 역류 크로마토그래피(CCC) 컬럼입니다. 이 스풀들은 로터 내부에 위치하며, 회전축은 주 회전축에 수직으로 배치됩니다.
CCC 컬럼의 액체 운동
정수압 CCC 컬럼 또는 CPC
그림 1에서 볼 수 있듯이, 두 가지 유형의 CCC 컬럼에서 액체의 거동은 상당한 차이를 보입니다. 액체 고정상이 정수압 컬럼의 채널 내에 물리적으로 고정된다는 것은 비교적 쉽게 이해할 수 있습니다. 이동상의 유속이 멈추면 두 액체상은 각자의 위치를 유지하므로 정수압이라는 용어가 사용됩니다. 고정상을 통과하는 이동상의 이동은 상대 밀도의 영향을 받습니다.
그림 1A에서 검은색 이동상은 가벼운 액체(시험관의 위쪽 상)를 나타냅니다. 이동상은 아래쪽에서 채널로 들어와 위쪽에서 나오는 것으로 묘사되는데, 이 과정을 상승 모드라고 하며, 이동상이 더 밀도가 높은 고정상을 통과하여 상승합니다.
반대로, 밀도가 높은 액상을 이동상으로 사용하는 경우, 액체는 위에서 채널로 들어와 아래로 빠져나가는데, 이를 하강 모드라고 합니다. 이 모드에서 밀도가 높은 이동상은 잔류하는 가벼운 고정상을 통과하여 아래로 내려갑니다. 그림 1A에서는 이동상이 작은 방울로 분해되는 모습이 나와 있습니다. 실제로, 이동상은 코리올리 효과로 인해 회전 방향으로 휘어지면서 고정상을 통과하며 챔버 벽이나 액체 계면에 충돌하면서 혼합 분무 또는 작은 방울을 생성합니다.
유체역학적 CCC 컬럼 또는 HSCCC
최근까지 유체역학 컬럼에서 액체 고정상을 유지하는 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다.
코일형 튜브가 달린 회전 보빈이나 스풀을 사용하는 시스템에서 나선형 구조는 아르키메데스 나사력이라고 알려진 힘을 발생시키며, 이 힘이 튜브에 담긴 액체를 압력이 더 높은 헤드라고 하는 튜브의 한쪽 끝으로 밀어냅니다.
반대로, 반대쪽 끝은 압력이 낮은 꼬리(tail)라고 합니다. 서로 섞이지 않는 두 액체가 회전하는 코일형 관이나 기둥에 주입되면, 밀도가 높은 액체는 꼬리 쪽으로 이동하여 가벼운 액체를 머리 쪽으로 밀어냅니다. 아르키메데스 나사력의 크기와 방향은 회전 속도뿐만 아니라 코일형 관의 방향과 나선형 피치의 영향을 받습니다.
유체역학적 CCC의 작품?
그림 1B에서 볼 수 있듯이, 더 가벼운 검은색 액체상이 회전 코일의 꼬리 부분에 유입되면, 일련의 혼합 및 침전 영역을 거쳐 더 밀도가 높은 액체를 통과하여 머리 부분에 도달합니다. 더 가벼운 상은 꼬리 부분에서 더 밀도가 높은 상을 통해 머리 부분으로 이동합니다. 더 밀도가 높은 상이 이동상 역할을 하는 경우, 머리 부분에서 CCC 컬럼으로 유입되어 더 가벼운 상을 통해 머리에서 꼬리 방향으로 이동해야 합니다. 회전자가 계속 회전하는 동안 이동상의 유량이 중단되면, 아르키메데스 나사 힘에 의해 더 가벼운 액체상은 코일의 머리 부분으로, 더 무거운 상은 꼬리 부분으로 이동합니다.
이러한 상들의 뚜렷한 이동은 이 공정을 유체역학적으로 특징짓습니다. 고정상은 이동상의 흐름에 대해 평형 상태를 유지하며, 이동상의 흐름이 증가하면 컬럼에서 고정상이 더 많이 이탈하여 잔류 고정상의 부피가 감소합니다.
크로마토그래피의 용매 시스템
세 가지 주요 기준
다양한 극성 또는 추출제를 포함하는 다양한 2상 용매 시스템을 이용하여 유기, 생물, 유기 및 무기 화합물을 분리할 수 있습니다. 이러한 시스템에서는 수용액상 또는 유기상이 이동상으로 사용될 수 있습니다.
일반적으로 분취 역류 크로마토그래피(CCC)용으로 확립된 용매 시스템은 분석 목적으로도 변형될 수 있습니다. 무기 분리에 사용되는 용매 시스템은 유기 분리에 사용되는 용매 시스템과 상당히 다르다는 점에 유의해야 합니다. 무기 분리에는 일반적으로 착화제 또는 추출제(리간드)가 포함되기 때문입니다.
2상 액체 시스템을 선택할 때 고려해야 할 세 가지 주요 기준은 다음과 같습니다.
- 첫째, 시스템은 서로 섞이지 않는 두 가지 상을 생성해야 합니다.
- 둘째, 선택된 고정상은 CCC 컬럼 내에 유지되어야 합니다.
- 마지막으로, 선택된 2상 액체 시스템은 샘플 분리를 효과적으로 촉진해야 합니다.
혼합할 수 없는 두 가지 상
다양한 용매 혼합물은 서로 섞이지 않는 두 개의 상을 생성할 수 있습니다. 분리하려는 유기 물질의 특성을 이해하면, 유사 화합물에 효과적으로 활용된 용매 시스템에 대한 기존 문헌을 참고하여 적절한 용매 시스템을 찾을 수 있습니다.
유기-수용성 2상 시스템에서 유기상은 단일 용매 또는 다양한 용매의 조합으로 구성될 수 있습니다. 헵탄/아세토니트릴과 같은 다양한 비수용성/비수용성 용매 시스템이 비극성 화합물 및/또는 수용성 환경에서 불안정한 화합물의 분리에 사용되어 왔습니다.
다양한 수성/수성 고분자상 시스템을 사용하여 거대분자와 세포 입자를 분리할 수 있습니다. 사용 가능한 고분자상 시스템 중 두 가지 유형이 역류 크로마토그래피(CCC)에 특히 다재다능합니다. 폴리에틸렌옥사이드(PEO)/인산칼륨 시스템은 선택한 PEO의 분자량을 변경하거나 인산 완충액의 pH 및/또는 농도를 변경하여 거대분자 분배 계수를 조절할 수 있습니다. PEO 6000/덱스트란 500 시스템은 전해질을 첨가하여 삼투압과 pH를 최적화함으로써 포유류 세포 분리에 유리한 생리적 환경을 조성합니다.
액체 고정상의 상당한 유지
액체 고정상의 효과적인 유지에 기여하는 요인은 코일에 사용된 튜빙 직경, 코일 크기, β 비(그림 3 참조)를 포함한 CCC 컬럼의 특성에 영향을 받습니다. 또한, 회전 속도 및 이동상의 유속과 같은 실험 조건도 중요한 역할을 합니다. 2상 액체 시스템의 물리화학적 특성 또한 액체 고정상의 최적 유지를 보장하는 데 필수적입니다.
주요 매개변수로는 액상 간의 밀도차, 이동상의 점도, 그리고 계면장력이 있으며, 이 모든 요소는 SF 비율에 상당한 영향을 미칩니다. 예를 들어, PEO, 인산칼륨, 그리고 물로 구성된 수용성 2상 시스템(ATPS)은 낮은 계면장력, PEO 상층의 높은 점도, 그리고 미세한 밀도차로 인해 유체역학 컬럼에서 어려움을 겪습니다. 그러나 ATPS는 정수압 컬럼에서 효과적으로 활용될 수 있습니다.
또한, 특히 무기 분리의 경우, 2상 시스템에 추출제와 무기염을 통합하면 액체 시스템의 물리화학적 특성에 큰 영향을 미쳐 유체역학적 거동과 고정상의 보유 값에 영향을 미칠 수 있습니다.
정지상의 액체적 특성을 활용한 독특한 방법
아래는 역류 크로마토그래피(CCC)에서 고정상의 액체 특성을 활용한 세 가지 주요 응용 사례입니다. 각 방법론은 고정상에 용질이 과도하게 잔류하는 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이러한 크로마토그래피 분리 기술은 고체 고정상을 사용하는 다른 방법에서는 구현이 불가능합니다.
듀얼 모드 방식
듀얼 모드 역류 크로마토그래피(CCC)에서 분리 공정은 이동상과 고정상을 중간에 전환하는 과정을 포함합니다. 이는 컬럼을 통해 펌핑되는 상과 흐름 방향을 모두 변경해야 합니다. 이러한 전환은 용출 순서를 방해할 수 있지만, 일반적으로 컬럼에서 전체 시료를 용출하는 데 효과적입니다. 듀얼 모드 CCC 방식은 분리 과정 중에 이동상을 변경할 수 있도록 하여 초기 고정상에 대한 친화도가 높은 화합물에 유리합니다. 이 방법은 고정상과 이동상의 액체 특성을 활용하여 분리 효율을 향상시킵니다.
동시 CCC
동시 역류 크로마토그래피(CCC)는 컬럼에 강하게 잔류하는 용질을 용출하는 대안적인 접근법을 제시합니다. 이 기술은 두 개의 펌프를 사용하며, 액체 고정상은 이동상과 같은 방향으로 점진적으로 이동합니다. 일반적으로 고정상의 유속은 이동상의 1% 미만으로 유지됩니다. 이 방법은 수용성 이동상과 느리게 움직이는 옥탄-1-올 고정상을 함께 사용하여 물에서 옥탄-1-올의 분배 상수를 측정하는 데 효과적으로 활용되었습니다.
용출-압출법
액체 고정상에 대해 강한 친화력을 나타내는 용질을 회수하는 또 다른 방법은 원심분리기 작동이 중단된 후 컬럼 한 부피가 용출된 후 컬럼 내용물 전체를 추출하는 것입니다. 연구에 따르면 밴드 확장의 대부분은 용질이 이동상을 통해 컬럼을 빠져나갈 때 발생합니다. 두 액체상이 상호 작용하는 컬럼 내부에서는 피크가 좁은 상태로 유지됩니다. 컬럼에서 두 액체상을 추출하면 좁은 피크가 그대로 유지되어 예상치 못한 높은 피크 분해능을 얻을 수 있습니다.
