Diferentes tipos de fases estacionárias em cromatografia líquida

Definição:

As fases estacionárias de HPLC são componentes sólidos ou imobilizados utilizados na cromatografia líquida de alta eficiência para promover a separação de compostos de uma mistura. Ao interagir com os componentes de uma amostra — ou de uma mistura de amostras — com base na afinidade entre tais componentes e a própria fase estacionária, esta auxilia na retenção ou na eluição dos componentes da mistura. A fase estacionária deve ser insensível a variações de temperatura, apresentar natureza quimicamente inerte e não reagir com a fase móvel ou com os componentes da mistura. Além disso, o material utilizado para a preparação da fase estacionária deve ser não volátil.

A fase estacionária e a fase móvel são os dois requisitos básicos e fundamentais para a separação dos componentes de uma mistura. Quando a fase estacionária interage com a fase móvel, ela potencializa e facilita o processo de separação dos componentes de uma mistura. A fase móvel e a fase estacionária são essenciais para a otimização de separações cromatográficas. Neste artigo, exploraremos e compararemos as principais características da fase estacionária. Mais de 50 tipos diferentes de fases estacionárias estão descritos no capítulo geral <621> da USP, o que nos dá uma noção básica da vastidão do assunto (química de fases estacionárias).

Materiais de Apoio Comuns

A sílica porosa é o suporte sólido mais comum para fases estacionárias em cromatografia líquida. A fase estacionária pode apresentar-se de diferentes formas, como partículas sólidas, partículas revestidas com líquido ou um suporte sólido com fase ligada. O tamanho das partículas da fase estacionária também desempenha um papel importante na separação e na resolução. Partículas menores proporcionam maior resolução e boa separação devido à maior área superficial, mas existe a possibilidade de aumento da contrapressão. Por outro lado, o uso de partículas maiores reduz a contrapressão, mas pode resultar em separação e resolução insatisfatórias. Quando a separação se baseia no tamanho e no peso molecular, o tamanho dos poros da fase estacionária também é um fator relevante em determinadas separações. A química de superfície da fase estacionária é outro fator importante, e a escolha dessa química depende dos analitos a serem separados.

Fases estacionárias à base de sílica

A sílica porosa contém grupos silanol (Si-OH) que conferem reatividade química e elevada resistência mecânica, além de proporcionar uma grande área superficial; por isso, é amplamente utilizada como suporte sólido, embora apresente certas limitações, sendo adequada para uso na faixa de pH de 2 a 9. Em valores de pH mais elevados, ela sofre ionização, enquanto em pH inferior a 2, derivados ancorados podem ser liberados devido à quebra da ligação Si-C.

Diferentes tipos de fases estacionárias:

Estão disponíveis diferentes tipos de fases estacionárias, e a escolha da fase estacionária depende da molécula a ser analisada, de seu tamanho e de seu peso. De modo geral, utilizam-se vários tipos principais de fase estacionária:

Fase estacionária de fase reversa:

Esta é a fase estacionária mais comum utilizada em HPLC. Ela é composta por sílica quimicamente modificada com grupos apolares. Compostos apolares ou moderadamente polares são analisados, e a separação é obtida utilizando-se essa fase estacionária. When seleção de colunas de HPLC para separação de compostos, Considere que a coluna mais popular nesta classificação é a de sílica ligada a uma cadeia de carbono octadecila (C18) (L1). A ela seguem-se a sílica ligada a C8 (L7), a sílica pura (L3), a sílica ligada a grupos ciano (CN) (L10), as colunas com grupos polares incorporados (amida), as fenilas fluoradas e a sílica ligada a grupos fenil (L11).

Químicas comuns de fase reversa

Octadecilsilano, octilsilano, fenil e ciano são as diferentes fases estacionárias de fase reversa que podem ser consideradas para a cromatografia de fase reversa. O octadecilsilano (C18) possui 18 átomos de carbono. O octilsilano (C8) possui apenas 8 átomos de carbono ligados à sílica (Si). A fase C18 retém compostos mais fortemente do que a C8. Interações pi-pi intensas ocorrem em colunas fenil, as quais podem oferecer uma seletividade específica em comparação com outras colunas de fase reversa.

A coluna fenil é a preferida para a análise e separação de compostos que contêm anéis aromáticos. Nas colunas ciano, a fase principal é a diisopropilcianopropil. Interações dipolo intensas atraem e separam moléculas polares, sendo essa coluna útil tanto no modo de fase reversa quanto no de fase normal.

Aplicações e Vantagens

A maioria dos compostos em análises farmacêuticas, biológicas e ambientais é polar e solúvel em água. Isso torna a fase reversa a fase estacionária preferida para a análise dos compostos mencionados, devido à sua compatibilidade com fases móveis de base aquosa. Ela apresenta uma ampla gama de aplicações, abrangendo desde compostos moderadamente polares até apolares, peptídeos, proteínas e produtos naturais. A fase reversa é considerada mais estável e reprodutível; utiliza solventes menos perigosos, é ecologicamente correta e conta com maior aceitação por parte dos órgãos reguladores.

Fase estacionária de fase normal:

Esta é a fase estacionária utilizada para separações seletivas. Ela consiste em sílica ou sílica modificada. Na fase normal, a fase estacionária é polar. As fases estacionárias mais utilizadas na cromatografia de fase normal são: (a) adsorventes inorgânicos, como sílica e alumina; ou (b) fases quimicamente ligadas de polaridade moderada, contendo grupos funcionais — tais como aminopropil, cianopropil, nitrofenil e diol — ligados quimicamente ao suporte de sílica gel.

Fases Estacionárias Quirais (CSPs)

Fases estacionárias quirais (CSPs) são materiais especializados utilizados na Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) para a separação de enantiômeros, que são moléculas que constituem imagens especulares não sobreponíveis. Existem diferentes tipos de fases estacionárias quirais disponíveis no mercado.

Essas fases estacionárias quirais são classificadas com base no componente seletor quiral que contêm. Assim, a fase estacionária desempenha um papel fundamental durante a análise e a separação de compostos quirais. Algumas categorias comuns incluem as CSPs à base de proteínas: estas utilizam proteínas naturais, como albumina ou globulina, como fase estacionária. Essas fases são empregadas na separação de misturas de enantiômeros. Tais CSPs são frequentemente utilizadas para separar uma ampla gama de compostos quirais, incluindo pequenas moléculas orgânicas.

Outras aplicações em fase normal

A fase estacionária de amino é utilizada para a separação de carboidratos, aminoácidos e moléculas polares. A fase estacionária de ciano também pode ser utilizada para a separação de moléculas moderadamente polares. Colunas quirais que utilizam celulose como fase estacionária são empregadas na separação de enantiômeros de moléculas quirais. Uma das fases quirais utiliza amilose como seletor quiral. Outra fase estacionária quiral é à base de proteínas.

3.Cromatografia de Troca Iônica

A cromatografia de troca iônica também é utilizada na cromatografia líquida. A fase estacionária desse tipo de cromatografia é composta por estireno-divinilbenzeno, contendo grupos carregados que atraem ou repelem as moléculas-alvo. Os trocadores aniônicos apresentam centros positivos em sua superfície e são utilizados para separar grupos sulfonatos, fosfatos ou carboxilatos. Por outro lado, os trocadores catiônicos possuem centros negativos na superfície e são empregados na separação de substâncias básicas, como as aminas. Essa fase estacionária é utilizada para a separação de proteínas, ácidos nucleicos e outras biomoléculas carregadas.

In ion exchange, either anion or cation exchange is used to separate negatively or positively charged compounds.

4.Cromatografia de exclusão por tamanho

A cromatografia de exclusão por tamanho divide-se em duas modalidades distintas: cromatografia de permeação em gel e cromatografia de filtração em gel, separando moléculas com base em seu tamanho e forma. A fase estacionária utilizada consiste em uma matriz polimérica porosa, cujos poros são preenchidos pelo solvente que servirá como fase móvel. Por ser constituída por uma matriz polimérica de natureza porosa, essa fase estacionária permite a entrada apenas de moléculas pequenas nos poros, excluindo as moléculas de maior porte; consequentemente, as moléculas maiores eluem primeiro, seguidas pela eluição das moléculas menores. Essa técnica é empregada para separar moléculas volumosas, como proteínas e polissacarídeos.

Conclusão:

Com base na discussão anterior, compreende-se que a fase estacionária é um dos fatores mais críticos na operação de HPLC para fins de análise. A escolha do tipo adequado de fase estacionária permite otimizar a separação com facilidade. Ao selecionar uma fase estacionária apropriada em conjunto com outros parâmetros, é possível otimizar o processo cromatográfico, economizar tempo e obter dados cada vez mais precisos e reprodutíveis. Compreender as diferenças fundamentais entre a cromatografia de fase reversa, fase normal, troca iônica e exclusão por tamanho permite que os analistas tomem decisões fundamentadas, com base nas propriedades químicas dos compostos de interesse. Seja na separação de enantiômeros com fases estacionárias quirais, na análise de biomoléculas carregadas por troca iônica ou na determinação de distribuições de massa molar por exclusão por tamanho, a escolha da fase estacionária determina o sucesso da separação. À medida que a cromatografia evolui com novas químicas de ligação e tecnologias de colunas, o domínio desses princípios fundamentais permanece essencial para alcançar resultados analíticos ideais.

Perguntas Frequentes:

Reference:

• Kaliszan, R. “Quantitative Structure Property (Retention) Relationships in Liquid Chromatography.” Liquid Chromatography, Elsevier, 2013, pp. 385–405, https://doi.org/10.1016/b978-0-12-415807-8.00017-1.
• ‌Mathew, Ceema, et al. “Stationary Phases Used in LC: A Detailed Review.” International Journal of Research Publication and Reviews Journal Homepage: Www.ijrpr.com, no. 6, 2025, pp. 1175–83, ijrpr.com/uploads/V6ISSUE7/IJRPR50170.pdf.