Por que a HPLC, por si só, não é suficiente para a qualificação de impurezas
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica analítica indispensável e essencial, amplamente utilizada em laboratórios de análise farmacêutica para ensaios de potência, estudos de dissolução, detecção de impurezas e muitas outras análises críticas. Trata-se de uma técnica simples, de fácil utilização, custo-benefício favorável e confiável, que assegura a precisão, a consistência e a reprodutibilidade das análises farmacêuticas. Desde a sua criação, avanços contínuos ampliaram as capacidades e as aplicações da HPLC, tornando-a um instrumento fundamental nos laboratórios farmacêuticos. Esses avanços incluem a cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC) — que proporciona maior resolução, análises mais rápidas e menor consumo de solventes — e a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS), um dos desenvolvimentos mais utilizados no âmbito da HPLC. Apesar dessas vantagens, a HPLC, por si só, não é suficiente para a qualificação de impurezas devido a certas limitações; tal processo não pode ser concluído sem o uso de técnicas complementares, como RMN e LC-MS. Este artigo aborda as limitações da HPLC e o papel de outros instrumentos analíticos avançados na qualificação de impurezas.
Limitações da HPLC
Embora a HPLC seja fundamental para a separação e quantificação de impurezas, ela apresenta certas limitações: problemas de coeluição, incapacidade de determinar estrutura e massa, alcance limitado para a quantificação de impurezas voláteis e incapacidade de detectar impurezas não sensíveis à radiação UV.
Problema de coeluição
Em uma matriz de amostra complexa, múltiplas impurezas podem estar presentes e eluir no mesmo tempo de retenção, o que pode resultar em quantificação incorreta ou falha na detecção.
Incapacidade de Determinar Informações Estruturais
Detectores de UV/visível utilizados em HPLC convencional podem detectar, quantificar e identificar impurezas com base no tempo de retenção e em dados espectrais, mas não conseguem determinar a massa, a estrutura ou a composição de um determinado componente.
Escopo Limitado
A HPLC é mais adequada para a análise de impurezas orgânicas não voláteis, mas não é útil para impurezas voláteis ou elementares. Estas requerem técnicas separadas e complementares para sua quantificação.
Insensibilidade a Certos Compostos
Algumas impurezas não possuem cromóforos e não absorvem luz UV, tornando-as difíceis ou quase impossíveis de detectar em um detector UV na técnica de HPLC padrão.
Sensibilidade de Detecção
As agências reguladoras exigem análises em nível de partes por bilhão (ppb), o que não é viável com HPLC-UV convencional, tornando necessários métodos avançados de LC-MS/MS ou GC-MS/MS.
Expectativas Regulatórias
Os órgãos reguladores exigem dados detalhados de caracterização para todas as impurezas durante o processo de submissão — dados que não podem ser obtidos apenas por HPLC. Em vez de dependerem exclusivamente de dados de HPLC, as agências agora solicitam informações abrangentes sobre isolamento, identificação e caracterização. Para atender a essa expectativa, utiliza-se frequentemente uma abordagem analítica moderna e multitécnica, combinando HPLC com LC-MS, GC-MS, ICP-MS e RMN: a LC-MS fornece a massa molecular e o padrão de fragmentação, elementos fundamentais para a identificação de impurezas orgânicas; a GC-MS identifica impurezas voláteis; a RMN fornece informações estruturais detalhadas; e a ICP-MS identifica e quantifica impurezas elementares.
Embora a LC-MS tenha se destacado como uma grande evolução em relação à HPLC, ela ainda apresenta algumas limitações e, atualmente, não pode ser considerada uma solução completa para a quantificação de impurezas. Algumas dessas limitações críticas são apresentadas a seguir.
Limitações da LC-MS
Ionização Suprimida
Alguns compostos não se ionizam completamente e, portanto, não são registrados na espectrometria de massas. Uma alta concentração de fármaco ou de excipientes na mistura pode suprimir o sinal de impurezas presentes em baixas concentrações. Esse fenômeno, denominado supressão iônica, torna as impurezas invisíveis à espectrometria de massas, mesmo quando detectadas por um detector de UV.
Incompatibilidade da Fase Móvel
Os métodos de HPLC utilizam, com frequência, tampões não voláteis que são incompatíveis com detectores de massa, exigindo o desenvolvimento de um método compatível com espectrometria de massa. A transição de um método de HPLC para um compatível com espectrometria de massa nem sempre é simples, e o processo pode introduzir alterações na ordem de eluição e no padrão de separação, dificultando a identificação de impurezas.
Estereoisômeros, como diastereoisômeros e enantiômeros, compartilham a mesma fórmula molecular e massa, além de produzirem os mesmos picos e padrões de fragmentação em um espectrômetro de massa, o que torna difícil distingui-los apenas por LC-MS.
Degradação
Em alguns casos, a degradação ocorre durante a ionização no espectrômetro de massas, o que pode levar à identificação equivocada de uma impureza fragmentada como uma impureza principal, resultando em um relato incorreto.
Embora a RMN não seja obrigatória para a qualificação de todas as impurezas, ela se torna essencial em muitos casos nos quais outras técnicas falham.
Se um fármaco possui um centro quiral, a espectrometria de massas e a HPLC podem apresentar um único pico, mas a RMN consegue diferenciar diastereoisômeros. Nesses casos, as agências reguladoras podem exigir dados de RMN como parte da documentação de qualificação. A RMN pode ser utilizada para identificar impurezas mesmo quando não há um padrão de referência disponível; ela identifica compostos desconhecidos por meio da análise do padrão de acoplamento spin-spin da impureza. Já a HPLC requer um padrão de referência para a identificação e quantificação de impurezas. Para as NDSRIs (impurezas de nitrosaminas relacionadas à substância ativa), que são estruturalmente semelhantes à substância ativa, a RMN é uma forma de confirmar a estrutura da impureza. A técnica de LC-MS pode fornecer dados de massa, mas não consegue diferenciar isômeros que compartilham a mesma massa, porém possuem estruturas distintas. Nessas situações, a RMN pode ser uma ferramenta valiosa para a identificação estrutural.
Conclusão
Nos últimos anos, as expectativas regulatórias para a qualificação de impurezas evoluíram para além de um processo simples e convencional, passando a enfatizar o gerenciamento completo de riscos, bem como a elucidação e a confirmação estruturais minuciosas por meio de tecnologias ortogonais de ponta. Assim, o uso isolado de HPLC não é suficiente para esse processo, no qual as técnicas de RMN e LC-MS desempenham um papel fundamental.
Perguntas frequentes
A HPLC não consegue determinar a estrutura e a massa da impureza. A HPLC não pode ser utilizada para impurezas voláteis e elementares. Atualmente, os órgãos reguladores exigem a qualificação e a quantificação de impurezas em níveis de ppb, o que não é possível com a HPLC. Por esse motivo, a HPLC, por si só, não é suficiente para a qualificação de impurezas.
A capacidade de uma molécula de sofrer supressão de ionização pode representar uma limitação significativa na detecção de impurezas por LC-MS. O uso de uma fase móvel seletiva é vantajoso apenas em LC-MS. No caso de isômeros que compartilham a mesma fórmula e massa, a técnica de LC-MS não é capaz de distingui-los.
Reference:
- Dong, Michael W, and Andrea Llanas. “The Essence of Modern HPLC: Advantages, Limitations, Fundamentals, and Opportunities.” ResearchGate, unknown, June 2013, https://www.researchgate.net/publication/342885307_The_Essence_of_Modern_HPLC_Advantages_Limitations_Fundamentals_and_Opportunities.
- “ICH Q3A (R2) Impurities in New Drug Substances – Scientific Guideline | European Medicines Agency (EMA).” European Medicines Agency (EMA), Oct. 2006, https://www.ema.europa.eu/en/ich-q3a-r2-impurities-new-drug-substances-scientific-guideline.
- Susha Cheriyedath, M.Sc. “News-Medical.” News-Medical, 19 Aug. 2016, https://www.news-medical.net/life-sciences/Liquid-Chromatography-Mass-Spectrometry-(LC-MS)-Applications.aspx.
