Diferentes tipos de fases estacionarias en cromatografía líquida
Definición:
Las fases estacionarias en HPLC son componentes sólidos o inmovilizados utilizados en la cromatografía líquida de alta resolución para lograr la separación de los compuestos de una mezcla. Al interactuar con los componentes de una muestra (o de una mezcla de muestras) en función de la afinidad existente entre dichos componentes y la propia fase estacionaria, esta última contribuye a retener o eluir los componentes de la mezcla. La fase estacionaria no debe verse afectada por la temperatura; debe ser químicamente inerte y no reaccionar con la fase móvil ni con los componentes de la mezcla. Asimismo, el material empleado para preparar la fase estacionaria debe ser no volátil.
La fase estacionaria y la fase móvil constituyen los dos requisitos básicos y fundamentales para la separación de los componentes de una mezcla. La interacción de la fase estacionaria con la fase móvil potencia y facilita el proceso de separación de los componentes. Ambas fases son esenciales para optimizar las separaciones cromatográficas. En este artículo, exploraremos y compararemos las características clave de la fase estacionaria. El capítulo general <621> de la USP describe más de 50 tipos diferentes de fases estacionarias, lo que nos da una idea de la gran amplitud de este tema (la química de las fases estacionarias).
Materiales de apoyo habituales
La sílice porosa es el soporte sólido más común para las fases estacionarias en cromatografía líquida. La fase estacionaria puede presentarse en diversas formas: como partículas sólidas, partículas recubiertas de líquido o un soporte sólido con una fase unida químicamente. El tamaño de partícula de la fase estacionaria también desempeña un papel fundamental en la separación y la resolución. Los tamaños de partícula más pequeños ofrecen una mayor resolución y una buena separación debido a su mayor área superficial, aunque existe el riesgo de un aumento en la contrapresión. Por el contrario, el uso de partículas de mayor tamaño reduce la contrapresión, pero conlleva el riesgo de obtener una separación y una resolución deficientes. Cuando la separación se basa en el tamaño y el peso molecular, el tamaño de poro de la fase estacionaria también resulta importante en determinados tipos de separación. Asimismo, la química superficial de la fase estacionaria es un factor relevante, y su elección depende de los analitos que se pretenden separar.
Fases estacionarias a base de sílice
La sílice porosa contiene grupos silanol (Si-OH) que presentan reactividad química y elevada resistencia mecánica, además de poseer una gran área superficial; por ello, es el soporte sólido más utilizado, aunque presenta ciertas limitaciones y su uso se restringe al intervalo de pH de 2 a 9. A valores de pH superiores, se ioniza, mientras que a pH inferiores a 2, los derivados unidos pueden desprenderse debido a la ruptura del enlace Si-C.
Diferentes tipos de fases estacionarias:
Existen diversos tipos de fases estacionarias, y la elección de una fase estacionaria depende de la molécula que se va a analizar, así como de su tamaño y peso. Por lo general, se utilizan varios tipos principales de fases estacionarias:
1.Fase estacionaria de fase inversa:
Esta es la fase estacionaria más común utilizada en HPLC. Está compuesta de sílice, modificada químicamente con grupos no polares. Se analizan compuestos no polares o moderadamente polares, y la separación se logra utilizando esta fase estacionaria. Cuando selección de columnas de HPLC para la separación de compuestos, Considere que la columna más popular en esta clasificación es la de sílice unida a una cadena de carbono octadecilo (C18) (L1). A esta le siguen la sílice unida a C8 (L7), la sílice pura (L3), la sílice unida a grupos ciano (CN) (L10), las columnas con grupos polares incorporados (amida), así como las de fenilo fluorado y sílice unida a fenilo (L11).
Químicas comunes de fase inversa
El octadecilsilano, el octilsilano, el fenilo y el ciano son las distintas fases estacionarias que pueden considerarse para la cromatografía de fase inversa. El octadecilsilano (C18) posee 18 átomos de carbono, mientras que el octilsilano (C8) cuenta únicamente con 8 átomos de carbono unidos a la sílice (Si). La fase C18 retiene los compuestos en mayor medida que la C8. En las columnas de fenilo se producen fuertes interacciones pi-pi, lo que puede ofrecer una selectividad especial frente a otras columnas de fase inversa.
La columna de fenilo es la preferida para el análisis y la separación de compuestos que contienen anillos aromáticos. En las columnas de ciano, la fase principal es el diisopropilcianopropilo; las fuertes interacciones dipolares atraen y separan las moléculas polares, resultando útiles tanto en el modo de fase inversa como en el de fase normal.
Aplicaciones y ventajas
La mayoría de los compuestos en los análisis farmacéuticos, biológicos y ambientales son polares y solubles en agua. Esto convierte a la fase inversa en la fase estacionaria preferida para el análisis de dichos compuestos, debido a su compatibilidad con fases móviles de base acuosa. Presenta un amplio rango de aplicaciones que abarca desde compuestos de polaridad moderada hasta apolares, así como péptidos, proteínas y productos naturales. La fase inversa se considera más estable y reproducible; emplea disolventes menos peligrosos, es respetuosa con el medio ambiente y goza de una mayor aceptación por parte de los organismos reguladores.
2. Fase estacionaria de fase normal:
Esta es la fase estacionaria utilizada para separaciones selectivas. Está compuesta por sílice o sílice modificada. En la cromatografía de fase normal, la fase estacionaria es polar. Las fases estacionarias más utilizadas en esta modalidad son: (a) adsorbentes inorgánicos, como la sílice y la alúmina, o (b) fases unidas químicamente de polaridad moderada que poseen grupos funcionales —tales como aminopropilo, cianopropilo, nitrofenilo y diol— unidos químicamente al soporte de gel de sílice.
Fases estacionarias quirales (CSP)
Las fases estacionarias quirales (CSP, por sus siglas en inglés) son materiales especializados utilizados en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para separar enantiómeros, los cuales son moléculas que constituyen imágenes especulares no superponibles entre sí. Existen diversos tipos de fases estacionarias quirales disponibles en el mercado.
Estas fases estacionarias quirales se clasifican según el componente selector quiral que contienen. Por consiguiente, la fase estacionaria desempeña un papel fundamental durante el análisis y la separación de compuestos quirales. Algunas categorías comunes incluyen las CSP basadas en proteínas: estas emplean proteínas naturales, como la albúmina o la globulina, como fase estacionaria. Estas fases se utilizan para separar mezclas de enantiómeros. A menudo, estas CSP se emplean para separar una amplia gama de compuestos quirales, incluidas moléculas orgánicas pequeñas.
Otras aplicaciones en fase normal
La fase estacionaria de amino se utiliza para la separación de carbohidratos, aminoácidos y moléculas polares. La fase estacionaria de ciano también puede emplearse para la separación de moléculas moderadamente polares. Las columnas quirales que utilizan celulosa como fase estacionaria se emplean para separar los enantiómeros de moléculas quirales. Una de las fases quirales utiliza amilosa como selector quiral. Otra fase estacionaria quiral está basada en proteínas..
3. Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico también se emplea en la cromatografía líquida. La fase estacionaria de esta técnica está compuesta por estireno-divinilbenceno, el cual posee un grupo cargado que atrae o repele las moléculas de interés. Los intercambiadores de aniones presentan centros positivos en su superficie y se utilizan para separar grupos sulfonato, fosfato o carboxilato. Por otro lado, los intercambiadores de cationes poseen centros negativos en la superficie y se emplean para separar sustancias básicas, como las aminas. Esta fase estacionaria se utiliza para la separación de proteínas, ácidos nucleicos y otras biomoléculas cargadas.
En el intercambio iónico, se recurre al intercambio de aniones o de cationes para separar compuestos cargados negativa o positivamente.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño
La cromatografía de exclusión por tamaño se divide en dos modalidades: la cromatografía de permeación en gel y la cromatografía de filtración en gel; esta técnica separa las moléculas según su tamaño y forma. La fase estacionaria empleada consiste en una matriz polimérica porosa cuyos poros están rellenos del disolvente que actúa como fase móvil. Dado que esta fase estacionaria está constituida por una matriz polimérica porosa, permite la entrada de moléculas pequeñas en los poros mientras excluye a las de mayor tamaño; en consecuencia, las moléculas grandes eluyen primero, seguidas por las moléculas pequeñas. Esta fase estacionaria se utiliza para separar moléculas voluminosas, tales como proteínas y polisacáridos.
Conclusión:
A partir de lo expuesto, se comprende que la fase estacionaria es uno de los factores más críticos al realizar análisis mediante HPLC. La elección del tipo adecuado de fase estacionaria permite optimizar la separación con facilidad. Al seleccionar una fase estacionaria apropiada en combinación con otros parámetros, es posible optimizar el proceso cromatográfico, ahorrar tiempo y obtener datos cada vez más precisos y reproducibles. Comprender las diferencias fundamentales entre la cromatografía de fase inversa, fase normal, intercambio iónico y exclusión por tamaño permite a los analistas tomar decisiones fundamentadas en las propiedades químicas de los compuestos de interés. Ya sea que se trate de separar enantiómeros con fases estacionarias quirales, analizar biomoléculas cargadas mediante intercambio iónico o determinar distribuciones de peso molecular por exclusión por tamaño, la elección de la fase estacionaria determina el éxito de la separación. A medida que la cromatografía evoluciona con nuevas químicas de enlace y tecnologías de columnas, dominar estos principios fundamentales sigue siendo esencial para lograr resultados analíticos óptimos.
Preguntas frecuentes
La principal diferencia entre las fases estacionarias de fase normal y de fase inversa radica en su polaridad. La cromatografía de fase normal utiliza una fase estacionaria muy polar, mientras que la cromatografía de fase inversa emplea una fase estacionaria no polar.
En el intercambio iónico, la separación se basa en la diferencia de carga, mientras que en la separación por exclusión por tamaño, esta depende del tamaño de la molécula.
La fase reversa es, por lo general, una fase estacionaria ampliamente utilizada, ya que permite lograr alrededor del 60 % de las separaciones; entre las fases estacionarias comunes de este tipo se encuentran la L1, L7, L10, L11 y L3.
Reference:
- Kaliszan, R. “Quantitative Structure Property (Retention) Relationships in Liquid Chromatography.” Liquid Chromatography, Elsevier, 2013, pp. 385–405, https://doi.org/10.1016/b978-0-12-415807-8.00017-1.
- Mathew, Ceema, et al. “Stationary Phases Used in LC: A Detailed Review.” International Journal of Research Publication and Reviews Journal Homepage: Www.ijrpr.com, no. 6, 2025, pp. 1175–83, ijrpr.com/uploads/V6ISSUE7/IJRPR50170.pdf.
