Gegenstromchromatographie

Man könnte meinen, dass der Begriff „Gegenstromchromatographie“ etwas irreführend ist, da die beiden flüssigen Phasen eigentlich nicht in entgegengesetzte Richtungen fließen. CCC ist eine Flüssigkeitschromatographietechnik, die durch eine flüssige stationäre Phase gekennzeichnet ist, die keinen festen Träger erfordert.

Der Ursprung von CCC (Gegenstromchromatographie)

Die Technik wurde von Yoichiro Ito entwickelt, der sie in Anlehnung an Craigs Gegenstromverteilungsmethode benannte, die ebenfalls die Trennung gelöster Stoffe durch Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen beinhaltete. Trotz des Potenzials für einen alternativen Namen wie „Trägerfreie Flüssigkeitschromatographie“ wurden die etablierte Terminologie und das Akronym „CCC“ in der Literatur weitgehend übernommen, so dass aufgrund der damit verbundenen umfangreichen Arbeiten jede Änderung unpraktisch ist.

Eine wesentliche Herausforderung bei CCC ist die Aufrechterhaltung einer stabilen, trägerlosen flüssigen stationären Phase. Im Gegensatz zur herkömmlichen Flüssigkeitschromatographie, bei der Säulen einfach aus Röhren mit Fritten an beiden Enden bestehen, nutzen moderne CCC-„Säulen“ Zentrifugalkräfte, um die flüssige stationäre Phase zu stabilisieren, während die flüssige mobile Phase durch sie hindurchgetrieben wird. Diese Abhängigkeit von Zentrifugalkräften erfordert den Einsatz rotierender Komponenten wie Rotoren, Zahnräder, Spulen, rotierende Dichtungen, Motoren und Geschwindigkeitsregler. Letztendlich fungiert die gesamte CCC-Apparatur als chromatographische Säule.

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Vorteile einer flüssigen stationären Phase ohne Unterstützung

Flexibilität

Bei der CCC kann jede Phase als mobile Phase dienen. Darüber hinaus ist es möglich, die mobile Phase während eines Laufs zu ändern, wenn die Komponenten der injizierten Probe über einen längeren Zeitraum in der Säule verbleiben. Es sind mindestens zwei nicht mischbare Lösungsmittel erforderlich, beispielsweise Wasser in Kombination mit Octan-1-ol, Heptan oder Chloroform. Übliche Phasensysteme für organische Trennungen können drei, vier oder sogar mehr Lösungsmittel enthalten. Die Verwendung von Phasendiagrammen kann einem Bediener dabei helfen, das am besten geeignete zweiphasige Flüssigkeitssystem für eine bestimmte Anwendung zu entwerfen.

Eindeutige Möglichkeiten von CCC

Die Hauptbeschränkung bei der Verwendung einer flüssigen stationären Phase liegt in ihrer inhärenten Beschaffenheit als Flüssigkeit. Während eine feste stationäre Phase problemlos in einer Säule enthalten sein kann, wird die Aufrechterhaltung der Stabilität einer flüssigen stationären Phase zu einer Herausforderung, wenn eine mobile Phase, ebenfalls in flüssiger Form, eingeführt wird. Die Craig-Maschine und die einfachen Tröpfchen-CCC-Geräte stützten sich zu diesem Zweck auf das Gravitationsfeld der Erde. Diese geringe Gravitationskraft erforderte jedoch langsame Flussraten der mobilen Phase, was zu Experimenten führte, die sich über mehrere Tage erstrecken konnten.

Neue CCC-Säulen mit rotierenden Komponenten

Um dieses Problem anzugehen, waren stärkere Zentrifugalfelder erforderlich, was zur Entwicklung moderner CCC-Säulen mit rotierenden Komponenten wie Rotoren und Zahnrädern führte. Diese Innovationen ermöglichen die Schaffung eines robusten und effizienten Zentrifugalfeldes, das ein erhebliches Volumen der flüssigen stationären Phase wirksam gegen den Fluss der mobilen Phase stabilisieren kann.

Das umfangreiche Angebot an Lösungsmittelkombinationen für zweiphasige Flüssigkeitssysteme bietet zwar mehr Flexibilität, kann jedoch auch Herausforderungen mit sich bringen, da die Auswahl der geeigneten Kombination zeitaufwändig sein kann, insbesondere für diejenigen, die mit dem Verfahren nicht vertraut sind. Es ist wichtig zu bedenken, dass jede Änderung in der Zusammensetzung einer flüssigen Phase die andere beeinflussen kann, was die Gradientenelution in der CCC im Vergleich zur herkömmlichen Flüssigkeitschromatographie erschwert.

Dynamische Phasenmischung

Bei der Gegenstromchromatographie (CCC) wird die Zugänglichkeit der stationären Phase für die getrennten Komponenten durch die Diffusionsprozesse innerhalb der Flüssigkeiten und die Wirksamkeit der Phasenmischung beeinflusst, die durch die Designspezifikationen der Säulen, die hydrodynamischen Betriebsbedingungen usw. bestimmt wird die physikalisch-chemischen Eigenschaften des zweiphasigen Flüssigkeitssystems.

CCC erleichtert auf einzigartige Weise die dynamische Phasenmischung eines zweiphasigen Flüssigkeitssystems während des gesamten chromatographischen Prozesses. Der Einsatz von Kieselsäure als Grundmaterial für die stationäre Phase in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) begrenzt den pH-Wert der mobilen Phase auf einen Bereich von 2 bis 8. Saure mobile Phasen können dabei zur Spaltung der organisch gebundenen Einheit führen basische Phasen können die Kieselsäure lösen; moderne und kostspielige stationäre HPLC-Phasen können jedoch effektiv mit mobilen Phasen bei pH 1 und/oder pH 10 arbeiten. Wenn umgekehrt die zur Schaffung des zweiphasigen Flüssigkeitssystems verwendeten Lösungsmittel nicht pH-empfindlich sind, gibt es keine zusätzlichen pH-bezogenen Probleme. da Teflon das am häufigsten verwendete Material in CCC-Säulen ist.

Starke Wechselwirkungen zwischen gelösten Stoffen und der stationären Phase können sich negativ auf biologische Materialien in der HPLC auswirken. Im Gegensatz dazu verlässt sich CCC ausschließlich auf die Flüssig-Flüssig-Verteilung zur Rückhaltung gelöster Stoffe, was Moleküle schonen und dabei helfen kann, ihre biologische Aktivität aufrechtzuerhalten.

Gelöste Stoffe können das beträchtliche Volumen der stationären Phase nutzen

CCC ist zweifellos eine wirksame präparative Trenntechnik, deren erheblicher Vorteil aus der flüssigen Beschaffenheit der stationären Phase resultiert, die die Beladbarkeit erhöht. Das eingebrachte Material kann sich im gesamten Volumen der stationären Phase vollständig auflösen. Darüber hinaus weisen Flüssig-Flüssigkeit-Adsorptionsisothermen im Vergleich zu Flüssig-Fest-Isothermen einen breiteren linearen Bereich auf.

Das Problem der Überlastung der stationären Phase ist bei CCC weniger ausgeprägt als bei der herkömmlichen HPLC, was vor allem auf das beträchtliche Volumen der stationären Phase zurückzuführen ist, das bis zu 90 % des gesamten Säulenvolumens ausmachen kann. Diese Eigenschaft von CCC kann sich für die analytische Chemie als vorteilhaft erweisen, insbesondere wenn sie zur Herstellung von Standardreferenzmaterialien verwendet wird.

CCC-SÄULEN

Von den verschiedenen Säulendesigns, die zur Aufrechterhaltung einer stationären flüssigen Phase eingesetzt werden, haben sich nur zwei als vielversprechend für eine weitere kommerzielle Weiterentwicklung erwiesen. Diese werden als hydrostatische und hydrodynamische Konfigurationen bezeichnet.

Hydrostatische CCC-Säulen

Die anfänglichen hydrostatischen Gegenstromchromatographiesäulen (CCC) nutzten die Schwerkraft, um die flüssige stationäre Phase an Ort und Stelle zu halten, und wurden als Tröpfchen-CCC-Säulen (DCCC) bezeichnet. Diese Säulen erforderten lange Elutionszeiten, die sich oft über mehrere Tage erstreckten, und sind mittlerweile veraltet. Moderne hydrostatische CCC-Säulen werden als Zentrifugalverteilungschromatographen (CPCs) anerkannt und verkauft. Zu ihren Hauptmerkmalen gehören: (1) eine einzelne Rotationsachse, die ein gleichmäßiges Zentrifugalfeld erzeugt, und (2) das Vorhandensein geometrischer Volumina wie Röhren, Kanäle oder Kammern, die durch Verbindungsröhren miteinander verbunden sind, um ein bestimmtes Muster zu bilden . Abb. 1A

Abbildung 1: zeigt die schematische Darstellung der Flüssigkeitsbewegung innerhalb von CCC-Säulen. Abbildung 1A – Hydrostatische Säulen oder kontinuierliche Phasensäulen (CPCs) verfügen über eine einzelne Rotationsachse, die ein konstantes Zentrifugalfeld (G) erzeugt, ohne dass in den Verbindungskanälen Phasenwechselwirkungen auftreten. Abbildung 1B – Hydrodynamische Säulen weisen ein variables und zyklisches Zentrifugalfeld (G) auf, das aus der Planetenrotation des Spulenkörpers um seine eigene Achse sowie die zentrale Rotorachse resultiert. Im gesamten Schlauch kommt es zu Wechselwirkungen zwischen den beiden flüssigen Phasen, wobei die mobile Phase schwarz und die stationäre Phase weiß dargestellt ist.

Minimierung der Kontaktzeit für die Wechselwirkung gelöster Stoffe

Bemerkenswert ist, dass es ein beträchtliches Volumen an Verbindungskanälen gibt, die ausschließlich die mobile Phase enthalten. Diese Konfiguration minimiert die Kontaktzeit für die Wechselwirkung des gelösten Stoffes mit der stationären Phase und erzeugt einen kleinen hydrostatischen Druck, der den erheblichen Druckabfall erklärt, der für den Betrieb hydrostatischer Zentrifugen erforderlich ist.

Alle hydrostatischen Zentrifugen sind mit zwei Rotationsdichtungen ausgestattet, eine oben und die andere unten, und arbeiten geräuscharm. Beim Ringspulen-CCC-System (Helix CCC), das unter Zentrifugalkraft arbeitet, sind die Abmessungen der Spule für analytische Trennungen optimiert. Die Spule ist um den äußeren Rand der Zentrifugenschüssel herum positioniert, sodass das stabile, radial wirkende Zentrifugalkraftfeld die stationäre Phase auf einer Seite der Spule aufrechterhalten kann, ähnlich dem zuvor beschriebenen grundlegenden hydrostatischen System.

Hydrodynamische CCC-Säulen

In CCC-Säulen verwendete hydrodynamische Zentrifugen verfügen über zwei Rotationsachsen: eine Primärachse und eine Planetenachse, die ein variables Zentrifugalkraftfeld erzeugt. Während mehrere Planetenachsen eingesetzt werden können, sind die am weitesten verbreiteten Konfigurationen Einzel-, Doppel- und Dreifachachsen. Jede Planetenachse ist mit einer Spule oder Spule ausgestattet, die Spulen aus kontinuierlich gewickelten Teflonschläuchen beherbergt.

Bei hydrodynamischen Säulen ist das Verständnis des Verhältnisses des Spulenradius r zum Rotorradius R von entscheidender Bedeutung. Dieses Verhältnis wurde historisch als β bezeichnet. In der Flüssigkeitschromatographie ist β als Phasenverhältnis VS/VM definiert, was dazu führt, dass das CCC-Beta-Verhältnis als βr = r/R ausgedrückt wird. Abb. 2

Hochgeschwindigkeits-CCC

Der Schlauch kann extern an die Zentrifuge angeschlossen, um die Spulen gewickelt und nach außen zurückgeführt werden, ohne dass Rotationsdichtungen erforderlich sind, sodass er aus chromatographischer Sicht effektiv wie eine einzige lange, dünne kontinuierliche Säule funktioniert. Das variable Kraftfeld ermöglicht Misch- und Absetzzonen entlang der gesamten Länge der gewickelten Säule, wie in der beigefügten Abbildung 1B dargestellt. In der gesamten Säule findet eine kontinuierliche Wechselwirkung zwischen den beiden flüssigen Phasen statt, ohne dass es zu einem nennenswerten Druckaufbau kommt. Hydrodynamische Zentrifugen arbeiten bei niedrigen Drücken der mobilen Phase, obwohl sie möglicherweise Geräusche von der Getriebebaugruppe erzeugen, die bei ausgereiften Konstruktionen minimiert werden können. Diese Säulen werden oft als Hochgeschwindigkeits-CCC-Säulen (HSCCC) bezeichnet, da sie im Vergleich zu Craig-, DCCC- und schwerkraftbetriebenen Säulen mit viel höheren Geschwindigkeiten arbeiten können.

Abbildung 2: zeigt eine schematische Darstellung der rotierenden Spule in einem hydrodynamischen CCC-Instrument, das über ein Planetengetriebesystem verfügt.

Ein Vergleich der Merkmale der beiden Typen von CCC-Säulen ist in Tabelle 1 dargestellt. Es ist nicht möglich, einen Typ als definitiv dem anderen überlegen zu erklären; Der optimale Ansatz besteht darin, beide Arten von CCC-Säulen zu verwenden, um ein breites Spektrum an Szenarien abzudecken. Die laufende Forschung zielt darauf ab, großtechnische CCC-Zentrifugen zu entwickeln, die erhebliche Mengen an gereinigtem Material produzieren können (präparatives CCC). Solche Zentrifugen sind für die Herstellung von Standardreferenzmaterialien für analytische Anwendungen und für die Reinigung analytischer Reagenzien bestimmt.

Vergleich der Eigenschaften hydrodynamischer und hydrostatischer Säulen

Spalte	Hydrodynamisch	Hydrostatisch
Flüssigkeit bleibt darin zurück	Gewickelte Teflonschläuche	Kanäle
Handelsname und Akronym	Spulenplanetenzentrifuge, Hochgeschwindigkeits-Gegenstromchromatograph, HSCCC	Zentrifugaler Verteilungschromatograph, CPC
Zentrifugalfeld	Variabel, zwei Drehachsen	Konstant, eine Rotationsachse
Retention in der stationären Phase	Variable	Gut
Effizienz	Bis zu 4 Platten pro Rohrumdrehung	Bis zu 1 Platte pro Kanal
Druck	Niedrig, 0,1–10 kg/cm2	Mittel, 2–70 kg/cm2
Wartung	Verbindungsschläuche alle ca. 100 Stunden wechseln	Rotierende Dichtungen zur Schmierung alle ca. 100 Stunden
Andere	Mögliche laute Getriebeanordnung, leisere Zentrifuge mit Riemenantrieb	Leise Zentrifuge

Kreuzachsenchromatographen sind Säulen für die hydrodynamische Gegenstromchromatographie (CCC), die über zwei Spulen aus gewickelten Schläuchen verfügen. Diese Spulen sind in einem Rotor positioniert, wobei ihre Drehachsen senkrecht zur primären Drehachse ausgerichtet sind.

Flüssigkeitsbewegung in CCC-Säulen

Hydrostatische CCC-Säulen oder CPCs

Wie in Abbildung 1 dargestellt, weist das Verhalten der Flüssigkeit in den beiden Arten von CCC-Säulen erhebliche Unterschiede auf. Es ist relativ einfach zu verstehen, dass die flüssige stationäre Phase physisch in den Kanälen der hydrostatischen Säulen gehalten wird. Wenn die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase gestoppt wird, bleiben beide flüssigen Phasen an ihrer jeweiligen Position, weshalb der Begriff hydrostatisch verwendet wird. Die Bewegung der mobilen Phase durch die stationäre Phase wird durch ihre relative Dichte beeinflusst.

In Abbildung 1A stellt die schwarze mobile Phase die leichtere Flüssigkeit dar (die obere Phase in einem Reagenzglas). Dargestellt ist der Eintritt in den Kanal am unteren Ende und der Austritt am oberen Ende – dieser Vorgang wird als aufsteigender Modus bezeichnet, bei dem die mobile Phase durch die dichtere stationäre Phase, die zurückgehalten wird, aufsteigt.

Wenn umgekehrt die dichtere flüssige Phase als mobile Phase verwendet wird, tritt sie von oben in den Kanal ein und verlässt ihn unten. Dies wird als absteigender Modus bezeichnet, bei dem die dichtere mobile Phase durch die leichtere stationäre Phase, die zurückgehalten wird, absteigt. In Abbildung 1A ist die Fragmentierung der mobilen Phase in Tröpfchen dargestellt. In der Praxis strömt die mobile Phase kaskadierend durch die stationäre Phase, krümmt sich aufgrund des Coriolis-Effekts in Rotationsrichtung und erzeugt beim Auftreffen auf die Kammerwand oder die Flüssigkeitsgrenzfläche einen Mischspray oder Tröpfchen.

Hydrodynamische CCC-Säulen oder HSCCC

Bis vor kurzem waren die Mechanismen hinter der Retention der flüssigen stationären Phase in hydrodynamischen Säulen nicht vollständig verstanden.

In Systemen, die rotierende Spulen oder Spulen mit gewickelten Rohren verwenden, erzeugt die helikale Struktur eine Kraft, die als archimedische Schraubenkraft bekannt ist und die enthaltenen Flüssigkeiten zu einem Ende des Rohrs, dem sogenannten Kopf, treibt, wo der Druck höher ist.

Umgekehrt wird das gegenüberliegende Ende als Schwanz bezeichnet und zeichnet sich durch einen geringeren Druck aus. Wenn zwei nicht mischbare Flüssigkeiten in die rotierende Rohrschlange oder Säule eingeleitet werden, wandert die dichtere Flüssigkeit zum hinteren Ende und drückt dadurch die leichtere Flüssigkeit zum Kopfende. Größe und Richtung der archimedischen Schraubenkraft werden von der Drehzahl sowie der Richtung und der Spiralsteigung der Rohrwendel beeinflusst.

Die Arbeiten des hydrodynamischen CCC?

Wie in Abbildung 1B dargestellt, durchläuft die leichtere schwarze Flüssigkeitsphase, wenn sie am Ende der rotierenden Spule eingeführt wird, die dichtere Flüssigkeit in einer Reihe von Misch- und Absetzzonen, bis sie den Kopf erreicht. Die leichtere Phase schreitet vom Schwanz zum Kopf durch die dichtere Phase voran. Wenn die dichtere Phase als mobile Phase dient, sollte sie am Kopf in die CCC-Säule eingeführt werden und sich von Kopf nach Schwanz durch die leichtere Phase bewegen. Sollte die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase gestoppt werden, während sich der Rotor weiter dreht, treibt die archimedische Schraubenkraft die leichtere flüssige Phase zum Kopfende der Spule und die schwerere Phase zum hinteren Ende.

Diese deutliche Bewegung der Phasen charakterisiert den Prozess als hydrodynamisch. Die stationäre Phase bleibt im Gleichgewicht gegenüber der Strömung der mobilen Phase; Eine Erhöhung dieses Flusses führt zu einer stärkeren Verdrängung der stationären Phase aus der Säule, was zu einem geringeren Volumen der zurückgehaltenen stationären Phase führt.

LÖSUNGSMITTELSYSTEME IN DER CHROMATOGRAPHIE

Drei Hauptkriterien

Für die Trennung organischer, bioorganischer und anorganischer Verbindungen können verschiedene zweiphasige Lösungsmittelsysteme verwendet werden, die sich durch ein breites Spektrum an Polaritäten oder den Einsatz von Extraktionsmitteln auszeichnen. In solchen Systemen kann entweder die wässrige oder die organische Phase als mobile Phase dienen.

Generell können Lösungsmittelsysteme, die für die präparative Gegenstromchromatographie (CCC) etabliert sind, auch für analytische Zwecke adaptiert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass sich die für anorganische Trennungen verwendeten Lösungsmittelsysteme erheblich von denen für organische Trennungen unterscheiden, da erstere typischerweise ein komplexierendes oder extrahierendes Mittel (Liganden) enthalten.

Bei der Auswahl eines Zweiphasen-Flüssigkeitssystems müssen drei Hauptkriterien berücksichtigt werden:

1. Erstens muss das System zwei nicht mischbare Phasen erzeugen.
2. Zweitens muss die gewählte stationäre Phase in der CCC-Säule erhalten bleiben.
3. Schließlich sollte das gewählte Zweiphasen-Flüssigkeitssystem die Trennung der Probe wirksam erleichtern.

Zwei nicht mischbare Phasen

Zahlreiche Lösungsmittelgemische können zwei nicht mischbare Phasen erzeugen. Wenn die Eigenschaften der zu isolierenden organischen Substanzen verstanden sind, ist es möglich, ein geeignetes Lösungsmittelsystem zu identifizieren, indem die vorhandene Literatur zu Lösungsmittelsystemen konsultiert wird, die für ähnliche Verbindungen effektiv eingesetzt wurden.

In organisch-wässrigen Zweiphasensystemen kann die organische Phase aus einem einzelnen Lösungsmittel oder einer Kombination verschiedener Lösungsmittel bestehen. Für die Trennung von unpolaren Verbindungen und/oder solchen, die in wässrigen Umgebungen instabil sind, wurden verschiedene nichtwässrige/nichtwässrige Lösungsmittelsysteme wie Heptan/Acetonitril eingesetzt.

Die Trennung von Makromolekülen und Zellpartikeln kann mithilfe einer Reihe von wässrigen/wässrigen Polymerphasensystemen erreicht werden. Unter den verfügbaren Polymerphasensystemen stechen zwei Typen als besonders vielseitig für die Gegenstromchromatographie (CCC) hervor. Die Poly(ethylenoxid) (PEO)/Kaliumphosphat-Systeme ermöglichen die Anpassung der Verteilungskoeffizienten von Makromolekülen durch Modifizierung des Molekulargewichts des gewählten PEO und/oder Änderung des pH-Werts und/oder der Konzentration des Phosphatpuffers. Die PEO 6000/Dextran 500-Systeme schaffen eine physiologische Umgebung, die die Trennung von Säugetierzellen begünstigt, indem sie Osmolarität und pH-Wert durch Zugabe von Elektrolyten optimieren.

Erhebliche Retention der flüssigen stationären Phase

Die Faktoren, die zur effektiven Retention der flüssigen stationären Phase beitragen, werden durch die Eigenschaften der CCC-Säule beeinflusst, einschließlich des für die Spulen verwendeten Rohrdurchmessers, der Spulengröße und des β-Verhältnisses (siehe Abbildung 3). Darüber hinaus spielen experimentelle Bedingungen wie die Rotationsgeschwindigkeit und die Flussrate der mobilen Phase eine entscheidende Rolle. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Zweiphasen-Flüssigkeitssystems sind auch für die optimale Retention der flüssigen stationären Phase von entscheidender Bedeutung.

Zu den wichtigsten Parametern gehören der Dichteunterschied zwischen den flüssigen Phasen, die Viskosität der mobilen Phase und die Grenzflächenspannung, die alle das SF-Verhältnis maßgeblich beeinflussen. Beispielsweise stellen wässrige Zweiphasensysteme (ATPSs), die aus PEO, Kaliumphosphat und Wasser bestehen, aufgrund ihrer niedrigen Grenzflächenspannung, der hohen Viskosität der PEO-Oberphase und des minimalen Dichteunterschieds eine Herausforderung in hydrodynamischen Säulen dar. Allerdings können ATPSs effektiv in hydrostatischen Säulen eingesetzt werden.

Darüber hinaus kann die Einbindung von Extraktionsmitteln und Mineralsalzen in ein Zweiphasensystem, insbesondere bei anorganischen Trennungen, die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Flüssigkeitssysteme stark beeinflussen und dadurch deren hydrodynamisches Verhalten und den Retentionswert der stationären Phase beeinflussen.

Einzigartige Methoden zur Nutzung der flüssigen Natur der stationären Phase

Nachfolgend sind drei verschiedene Anwendungen der Flüssigkeitseigenschaften der stationären Phase in der Gegenstromchromatographie (CCC) aufgeführt. In jedem Fall wurden die Methoden entwickelt, um das Problem zu lösen, dass gelöste Stoffe in der stationären Phase übermäßig zurückgehalten werden. Diese chromatographischen Trenntechniken wären mit anderen Methoden, die eine feste stationäre Phase verwenden, nicht durchführbar.

Dual-Mode-Methode

Bei der Dual-Mode-Gegenstromchromatographie (CCC) umfasst der Trennungsprozess einen Wechsel der mobilen und stationären Phase während des Laufs. Dies erfordert eine Änderung sowohl der durch die Säule gepumpten Phase als auch der Flussrichtung. Obwohl dieser Schalter die Elutionsreihenfolge unterbrechen kann, ist er im Allgemeinen wirksam, um die gesamte Probe von der Säule zu eluieren. Der Dual-Mode-CCC-Ansatz ermöglicht den Wechsel der mobilen Phase während der Trennung, was Verbindungen zugute kommen kann, die eine hohe Affinität zur anfänglichen stationären Phase aufweisen. Diese Methode nutzt die Flüssigkeitseigenschaften sowohl der stationären als auch der mobilen Phase für eine verbesserte Trennung.

Gleichzeitiger CCC

Die gleichzeitige Gegenstromchromatographie (CCC) stellt einen alternativen Ansatz dar, um die Elution stark zurückgehaltener gelöster Stoffe aus der Säule zu erleichtern. Bei dieser Technik kommen zwei Pumpen zum Einsatz, bei denen die flüssige stationäre Phase schrittweise in die gleiche Richtung wie die mobile Phase gefördert wird. Typischerweise wird die Flussrate der stationären Phase auf weniger als 1 % der Flussrate der mobilen Phase gehalten. Diese Methode wurde effektiv zur Bestimmung der Verteilungskonstanten von Octan-1-ol in Wasser eingesetzt, wobei eine wässrige mobile Phase neben einer sich langsam bewegenden stationären Octan-1-ol-Phase verwendet wurde.

Elution-Extrusion-Methode

Eine alternative Methode zur Rückgewinnung eines gelösten Stoffes, der eine starke Affinität zur flüssigen stationären Phase aufweist, besteht darin, den gesamten Inhalt der Säule zu extrudieren, nachdem die Zentrifuge den Betrieb eingestellt hat, nachdem ein Säulenvolumen eluiert wurde. Untersuchungen zeigen, dass der Großteil der Bandenverbreiterung auftritt, wenn die gelösten Stoffe die Säule in der mobilen Phase verlassen. Innerhalb der Säule, wo die beiden flüssigen Phasen interagieren, bleiben die Peaks schmal. Durch das Extrudieren der beiden Phasen aus der Säule bleiben die schmalen Peaks erhalten, was zu unerwartet hohen Peakauflösungsfaktoren führt.