Cromatografía a contracorriente

Se podría argumentar que el término «cromatografía a contracorriente» es algo engañoso, ya que las dos fases líquidas en realidad no fluyen en direcciones opuestas. CCC es una técnica de cromatografía líquida caracterizada por una fase estacionaria líquida que no requiere un soporte sólido.

El origen de la CCC (Cromatografía a contracorriente)

La técnica fue desarrollada por Yoichiro Ito, quien la nombró en referencia al método de partición contracorriente de Craig, que también implicaba la separación de solutos mediante la partición entre dos fases líquidas. A pesar de la posibilidad de un nombre alternativo como cromatografía líquida sin soporte, la terminología establecida y el acrónimo CCC han sido ampliamente adoptados en la literatura, lo que hace que cualquier cambio sea poco práctico debido al extenso trabajo asociado con ella.

Un desafío importante en CCC es mantener una fase estacionaria líquida estable y sin soporte. A diferencia de la cromatografía líquida tradicional, donde las columnas pueden consistir simplemente en tubos con fritas en cada extremo, las “columnas” CCC modernas utilizan fuerzas centrífugas para estabilizar la fase estacionaria líquida mientras la fase móvil líquida es impulsada a través de ella. Esta dependencia de las fuerzas centrífugas requiere el uso de componentes giratorios como rotores, engranajes, carretes, sellos giratorios, motores y reguladores de velocidad. En última instancia, todo el aparato CCC funciona como una columna cromatográfica.

Haga clic aquí si desea leer una descripción general sobre cromatografía.

Beneficios de una fase estacionaria líquida sin soporte Flexibilidad

En CCC, cualquiera de las fases tiene el potencial de servir como fase móvil. Además, es posible alterar la fase móvil durante una ejecución si los componentes de la muestra inyectada permanecen en la columna durante un período prolongado. Son necesarios al menos dos disolventes inmiscibles, como agua combinada con octan-1-ol, heptano o cloroformo. Los sistemas de fases comunes para separaciones orgánicas pueden incorporar tres, cuatro o incluso más disolventes. La utilización de diagramas de fases puede ayudar al operador a diseñar el sistema de líquido bifásico más apropiado para una aplicación específica.

Distintas oportunidades de CCC

La principal limitación de utilizar una fase estacionaria líquida es su naturaleza inherente como líquido. Si bien una fase estacionaria sólida puede contenerse fácilmente dentro de una columna, mantener la estabilidad de una fase estacionaria líquida se vuelve un desafío cuando se introduce una fase móvil, también en forma líquida. La máquina Craig y los dispositivos CCC de gotas básicos se basaron en el campo gravitacional de la Tierra para este propósito. Sin embargo, esta baja fuerza gravitacional requirió velocidades de flujo de fase móvil lentas, lo que llevó a experimentos que podrían extenderse durante varios días.

Nuevas columnas CCC con componentes giratorios

Para abordar este problema, se requerían campos centrífugos más fuertes, lo que impulsó el diseño de columnas CCC modernas con componentes giratorios como rotores y engranajes. Estas innovaciones permiten la creación de un campo centrífugo robusto y eficiente que puede estabilizar eficazmente un volumen significativo de la fase estacionaria líquida frente al flujo de la fase móvil.

Si bien la amplia gama de combinaciones de disolventes disponibles para sistemas líquidos bifásicos ofrece una mayor flexibilidad, también puede plantear desafíos, ya que seleccionar la combinación adecuada puede llevar mucho tiempo, especialmente para quienes no están familiarizados con el proceso. Es fundamental recordar que cualquier alteración en la composición de una fase líquida puede afectar a la otra, lo que complica la elución en gradiente en CCC en comparación con la cromatografía líquida tradicional.

Mezcla de fases dinámica

En la cromatografía contracorriente (CCC), la accesibilidad de la fase estacionaria para los componentes separados está influenciada por los procesos de difusión dentro de los líquidos y la efectividad de la mezcla de fases, que está determinada por las especificaciones de diseño de las columnas, las condiciones hidrodinámicas operativas y las características fisicoquímicas del sistema líquido de dos fases.

CCC facilita de manera única la mezcla dinámica de fases de un sistema líquido de dos fases durante todo el proceso cromatográfico. El empleo de sílice como material fundamental para la fase estacionaria en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) restringe el pH de la fase móvil a un rango de 2 a 8. Las fases móviles ácidas pueden conducir a la escisión del resto orgánico unido, mientras que las fases básicas pueden disolver la sílice; sin embargo, las fases estacionarias de HPLC modernas y costosas pueden funcionar eficazmente con fases móviles a pH 1 y/o pH 10. Por el contrario, cuando los disolventes utilizados para crear el sistema líquido bifásico no son sensibles al pH, no hay problemas adicionales relacionados con el pH. ya que el teflón es el material más utilizado en las columnas CCC.

Las fuertes interacciones entre los solutos y la fase estacionaria pueden afectar negativamente a los materiales biológicos en HPLC. Por el contrario, la CCC se basa únicamente en la partición líquido-líquido para la retención de solutos, lo que puede ser suave con las moléculas y ayudar a mantener su actividad biológica.

Los solutos pueden aprovechar el volumen sustancial de la fase estacionaria.

La CCC es sin duda una técnica de separación preparativa eficaz, con una ventaja significativa derivada de la naturaleza líquida de la fase estacionaria, que mejora la capacidad de carga. El material introducido puede disolverse completamente en todo el volumen de la fase estacionaria. Además, las isotermas de adsorción líquido-líquido exhiben un rango lineal más amplio en comparación con las isotermas líquido-sólido.

El problema de la sobrecarga de la fase estacionaria es menos pronunciado en CCC que en HPLC convencional, principalmente debido al volumen sustancial de fase estacionaria, que puede constituir hasta el 90% del volumen total de la columna. Esta característica de CCC puede resultar beneficiosa para la química analítica, particularmente cuando se utiliza para la preparación de materiales de referencia estándar.

COLUMNAS CCC

Entre los diversos diseños de columnas empleados para mantener una fase líquida estacionaria, sólo dos se han mostrado prometedores para un avance comercial continuo. Estas se conocen como configuraciones hidrostática e hidrodinámica.

Columnas hidrostáticas CCC

Las columnas iniciales de cromatografía hidrostática en contracorriente (CCC) utilizaban la gravedad para mantener la fase estacionaria líquida en su lugar y se denominaban columnas CCC de gotitas (DCCC). Estas columnas requerían tiempos de elución prolongados, que a menudo abarcaban varios días, y ahora están obsoletos. Las columnas CCC hidrostáticas contemporáneas se reconocen y venden como cromatógrafos de partición centrífuga (CPC). Sus características principales incluyen: (1) un único eje de rotación que crea un campo centrífugo consistente y (2) la presencia de volúmenes geométricos, como tubos, canales o lóculos, que están interconectados a través de tubos de conexión para formar un patrón específico. . Fig-1A

Figura 1: ilustra la representación esquemática del movimiento de líquido dentro de las columnas CCC. Figura 1A: Las columnas hidrostáticas o columnas de fase continua (CPC) cuentan con un único eje de rotación que genera un campo centrífugo constante (G), sin que se produzcan interacciones de fase en los conductos de conexión. Figura 1B – Las columnas hidrodinámicas exhiben un campo centrífugo (G) variable y cíclico, resultante de la rotación planetaria de la bobina alrededor de su propio eje, así como del eje central del rotor. A lo largo del tubo, existe interacción entre las dos fases líquidas, con la fase móvil representada en negro y la fase estacionaria en blanco.

Minimizar el tiempo de contacto para la interacción de solutos.

Cabe destacar que existe un volumen considerable de conductos de conexión que contienen únicamente la fase móvil. Esta configuración minimiza el tiempo de contacto para la interacción del soluto con la fase estacionaria y genera una pequeña presión hidrostática, lo que explica la importante caída de presión requerida para el funcionamiento de las centrífugas hidrostáticas.

Todas las centrífugas hidrostáticas están equipadas con dos sellos giratorios, uno ubicado en la parte superior y otro en la parte inferior, y funcionan de manera silenciosa. En el sistema de bobina toroidal CCC (hélice CCC), que funciona bajo fuerza centrífuga, las dimensiones de la bobina están optimizadas para separaciones analíticas. La bobina se coloca alrededor del borde exterior del recipiente centrífugo, lo que permite que el campo de fuerza centrífuga estable que actúa radialmente mantenga la fase estacionaria en un lado de la bobina, similar al sistema hidrostático básico descrito anteriormente.

Columnas CCC hidrodinámicas

Las centrífugas hidrodinámicas utilizadas en las columnas CCC cuentan con dos ejes de rotación: un eje primario y un eje planetario que crea un campo de fuerza centrífuga variable. Si bien se pueden emplear múltiples ejes planetarios, las configuraciones más frecuentes son ejes simples, dobles y triples. Cada eje planetario está equipado con una bobina o carrete que alberga bobinas de tubos de teflón enrollados continuamente.

En columnas hidrodinámicas, es crucial comprender la relación entre el radio del carrete, r, y el radio del rotor, R. Históricamente, esta relación se ha denominado β. En cromatografía líquida, β se define como la relación de fases VS/VM, lo que lleva a que la relación beta CCC se exprese como βr = r/R. Fig-2

CCC de alta velocidad

El tubo se puede conectar externamente a la centrífuga, enrollarse alrededor de las bobinas y devolverse al exterior sin necesidad de sellos giratorios, funcionando efectivamente como una única columna continua larga y delgada desde una perspectiva de cromatografía. El campo de fuerza variable facilita las zonas de mezcla y sedimentación a lo largo de toda la columna enrollada, como se ilustra en la figura 1B adjunta. La interacción continua entre las dos fases líquidas se produce en toda la columna sin una acumulación significativa de presión. Las centrífugas hidrodinámicas funcionan a bajas presiones de fase móvil, aunque pueden generar ruido en el conjunto de engranajes, que puede minimizarse en diseños bien diseñados. Estas columnas a menudo se denominan columnas CCC de alta velocidad (HSCCC) debido a su capacidad para operar a velocidades mucho más altas en comparación con las columnas Craig, DCCC y impulsadas por gravedad.

Figura 2: ilustra una representación esquemática de la bobina giratoria dentro de un instrumento CCC hidrodinámico que presenta un sistema de engranajes planetarios.

En la Tabla 1 se presenta una comparación de las características de los dos tipos de columnas CCC. No es factible declarar un tipo como definitivamente superior al otro; el enfoque óptimo es utilizar ambos tipos de columnas CCC para abordar una amplia gama de escenarios. La investigación en curso tiene como objetivo desarrollar centrífugas CCC a gran escala que puedan producir cantidades sustanciales de material purificado (CCC preparativa). Estas centrífugas están destinadas a la producción de materiales de referencia estándar para aplicaciones analíticas y para la purificación de reactivos analíticos.

Comparación de las propiedades de columnas hidrodinámicas e hidrostáticas

Columna	Hidrodinámico	Hidrostático
Líquido retenido en	Tubos de teflón en espiral	Canales
Nombre comercial y acrónimo	Centrífuga planetaria de bobina, cromatógrafo a contracorriente de alta velocidad, HSCCC	Cromatógrafo de partición centrífuga, CPC
Campo centrífugo	Variable, dos ejes de rotación.	Constante, un eje de rotación.
Retención de fase estacionaria	Variable	Bueno
Eficiencia	Hasta 4 placas por vuelta de tubo	Hasta 1 placa por canal
Presión	Bajo, 0,1-10 kg/cm2	Mediano, 2-70 kg/cm2
Mantenimiento	Tubo de conexión para cambiar cada ~100 h	Sellos giratorios para lubricar cada ~100 h
Otro	Posible conjunto de engranajes ruidoso, centrífuga más silenciosa con transmisión por correa	Centrífuga silenciosa

Tabla 1 Comparación de las propiedades de columnas hidrodinámicas e hidrostáticas.

Los cromatógrafos de eje transversal son columnas de cromatografía hidrodinámica en contracorriente (CCC) que cuentan con dos carretes de tubos flexibles. Estos carretes están colocados dentro de un rotor, con sus ejes de rotación orientados perpendiculares al eje de rotación principal.

Movimiento líquido en columnas CCC.

Columnas hidrostáticas CCC o CPC

Como se ilustra en la figura 1, el comportamiento del líquido en los dos tipos de columnas CCC presenta diferencias significativas. Es relativamente sencillo comprender que la fase estacionaria líquida se mantendrá físicamente dentro de los canales de las columnas hidrostáticas. Cuando se detiene el caudal de la fase móvil, ambas fases líquidas permanecen en sus respectivas posiciones, por lo que se aplica el término hidrostático. El movimiento de la fase móvil a través de la fase estacionaria está influenciado por sus densidades relativas.

En la figura 1A, la fase móvil negra representa el líquido más ligero (la fase superior en un tubo de ensayo). Se representa entrando al canal por el extremo inferior y saliendo por el extremo superior; este proceso se conoce como modo ascendente, donde la fase móvil se eleva a través de la fase estacionaria más densa que se retiene.

Por el contrario, si la fase líquida más densa se utiliza como fase móvil, entraría al canal por la parte superior y saldría por la parte inferior; esto se denomina modo descendente, donde la fase móvil más densa desciende a través de la fase estacionaria más ligera que se retiene. En la figura 1A, se muestra la fase móvil fragmentándose en gotas. En la práctica, la fase móvil cae en cascada a través de la fase estacionaria, curvándose en la dirección de rotación debido al efecto Coriolis, y genera una pulverización o gotas de mezcla al impactar con la pared de la cámara o la interfaz líquida.

Columnas CCC hidrodinámicas o HSCCC

Hasta hace poco, los mecanismos detrás de la retención de la fase estacionaria líquida en columnas hidrodinámicas no se conocían completamente.

En los sistemas que utilizan bobinas o carretes giratorios con tubos enrollados, la estructura helicoidal genera una fuerza conocida como fuerza del tornillo de Arquímedes, que impulsa los líquidos contenidos hacia un extremo del tubo, denominado cabeza, donde la presión es mayor.

Por el contrario, el extremo opuesto se denomina cola y se caracteriza por una presión más baja. Cuando se introducen dos líquidos inmiscibles en el tubo o columna en espiral giratorio, el líquido más denso migra hacia el extremo de cola, empujando así el líquido más ligero hacia el extremo de cabeza. La magnitud y dirección de la fuerza del tornillo de Arquímedes están influenciadas por la velocidad de rotación, así como por la dirección y el paso helicoidal del tubo enrollado.

¿Las obras de CCC hidrodinámicas?

Como se ilustra en la figura 1B, cuando la fase líquida negra más clara se introduce en la cola de la bobina giratoria, atraviesa el líquido más denso en una serie de zonas de mezcla y sedimentación hasta llegar a la cabeza. La fase más clara avanza desde la cola hasta la cabeza pasando por la fase más densa. Si la fase más densa sirve como fase móvil, debe introducirse en la columna CCC en la cabeza, moviéndose en dirección de cabeza a cola a través de la fase más ligera. Si se detiene el caudal de la fase móvil mientras el rotor continúa girando, la fuerza del tornillo de Arquímedes impulsará la fase líquida más ligera hacia el extremo de la cabeza de la bobina y la fase más pesada hacia el extremo de la cola.

Este movimiento distinto de las fases caracteriza el proceso como hidrodinámico. La fase estacionaria permanece en equilibrio frente al flujo de la fase móvil; un aumento de este flujo da como resultado un mayor desplazamiento de la fase estacionaria de la columna, lo que lleva a un volumen reducido de fase estacionaria retenida.

SISTEMAS SOLVENTES EN CROMATOGRAFÍA

Tres criterios principales

Para la separación de compuestos orgánicos, bioorgánicos e inorgánicos se puede utilizar una variedad de sistemas de disolventes de dos fases, caracterizados por una amplia gama de polaridades o la inclusión de agentes de extracción. En tales sistemas, la fase acuosa u orgánica puede servir como fase móvil.

Generalmente, los sistemas de disolventes que se establecen para la cromatografía preparativa en contracorriente (CCC) también se pueden adaptar con fines analíticos. Es importante señalar que los sistemas de disolventes utilizados para las separaciones inorgánicas difieren significativamente de los empleados para las separaciones orgánicas, ya que los primeros suelen incorporar un agente complejante o extractor (ligando).

Al seleccionar un sistema líquido de dos fases, se deben considerar tres criterios principales:

1. En primer lugar, el sistema debe producir dos fases inmiscibles.
2. En segundo lugar, la fase estacionaria elegida debe mantenerse dentro de la columna CCC.
3. Por último, el sistema líquido de dos fases seleccionado debería facilitar eficazmente la separación de la muestra.

Dos fases inmiscibles

Numerosas mezclas de disolventes pueden crear dos fases inmiscibles. Cuando se comprenden las características de las sustancias orgánicas que se van a aislar, es posible identificar un sistema disolvente apropiado consultando la literatura existente sobre sistemas disolventes que se han utilizado eficazmente para compuestos similares.

En los sistemas de dos fases orgánico-acuoso, la fase orgánica puede consistir en un único disolvente o en una combinación de varios disolventes. Se han empleado diferentes sistemas de disolventes no acuosos/no acuosos, como heptano/acetonitrilo, para la separación de compuestos no polares y/o aquellos que son inestables en ambientes acuosos.

La separación de macromoléculas y partículas celulares se puede lograr utilizando una variedad de sistemas de fases poliméricas acuosas/acuosas. Entre los sistemas de fases poliméricas disponibles, dos tipos destacan por ser particularmente versátiles para la cromatografía en contracorriente (CCC). Los sistemas de poli(óxido de etileno) (PEO)/fosfato de potasio permiten el ajuste de los coeficientes de partición de macromoléculas modificando el peso molecular del PEO elegido y/o cambiando el pH y/o la concentración del tampón fosfato. Los sistemas PEO 6000/Dextran 500 crean un entorno fisiológico propicio para la separación de células de mamíferos optimizando la osmolaridad y el pH con la adición de electrolitos.

Retención significativa de la fase estacionaria líquida.

Los factores que contribuyen a la retención efectiva de la fase estacionaria líquida están influenciados por las características de la columna CCC, incluido el diámetro del tubo utilizado para las bobinas, el tamaño de la bobina y la relación β (consulte la figura 3). Además, las condiciones experimentales como la velocidad de rotación y el caudal de la fase móvil juegan un papel crucial. Los atributos fisicoquímicos del sistema líquido de dos fases también son vitales para garantizar una retención óptima de la fase estacionaria líquida.

Los parámetros clave incluyen la diferencia de densidad entre las fases líquidas, la viscosidad de la fase móvil y la tensión interfacial, todos los cuales impactan significativamente la relación SF. Por ejemplo, los sistemas acuosos de dos fases (ATPS) compuestos de PEO, fosfato de potasio y agua presentan desafíos en las columnas hidrodinámicas debido a su baja tensión interfacial, la alta viscosidad de la fase superior de PEO y la mínima diferencia de densidad. Sin embargo, los ATPS se pueden utilizar eficazmente en columnas hidrostáticas.

Además, la incorporación de agentes extractantes y sales minerales en un sistema de dos fases, particularmente para separaciones inorgánicas, puede influir en gran medida en las propiedades fisicoquímicas de los sistemas líquidos, afectando así su comportamiento hidrodinámico y el valor de retención de la fase estacionaria.

Métodos únicos para utilizar la naturaleza líquida de la fase estacionaria

A continuación se presentan tres aplicaciones distintas de las características líquidas de la fase estacionaria en cromatografía contracorriente (CCC). En cada caso, las metodologías se crearon para abordar el problema de la retención excesiva de solutos en la fase estacionaria. Estas técnicas de separación cromatográfica no serían factibles con otros métodos que utilizan una fase estacionaria sólida.

Método de modo dual

En la cromatografía contracorriente de modo dual (CCC), el proceso de separación implica un cambio a mitad de proceso de las fases móvil y estacionaria. Esto requiere alterar tanto la fase que se bombea a través de la columna como la dirección del flujo. Si bien este cambio puede alterar el orden de elución, generalmente es eficaz para eluir toda la muestra de la columna. El enfoque CCC de modo dual permite cambiar la fase móvil durante la separación, lo que puede beneficiar a los compuestos que tienen una alta afinidad por la fase estacionaria inicial. Este método aprovecha las características líquidas de las fases estacionaria y móvil para mejorar la separación.

CCC concurrente

La cromatografía contracorriente concurrente (CCC) presenta un enfoque alternativo para facilitar la elución de solutos fuertemente retenidos de la columna. Esta técnica emplea dos bombas, donde la fase estacionaria líquida se impulsa gradualmente en la misma dirección que la fase móvil. Normalmente, el caudal de la fase estacionaria se mantiene en menos del 1% del de la fase móvil. Este método se ha utilizado eficazmente para determinar las constantes de partición de octan-1-ol en agua, utilizando una fase móvil acuosa junto con una fase estacionaria de octan-1-ol que se mueve lentamente.

Método de elución-extrusión

Un método alternativo para recuperar un soluto que muestra una fuerte afinidad por la fase estacionaria líquida implica extruir todo el contenido de la columna después de que la centrífuga haya dejado de funcionar, tras la elución de un volumen de la columna. Las investigaciones indican que la mayor parte del ensanchamiento de la banda se produce cuando los solutos salen de la columna en la fase móvil. Dentro de la columna, donde interactúan las dos fases líquidas, los picos siguen siendo estrechos. Al extruir las dos fases de la columna, se conservan los picos estrechos, lo que da como resultado factores de resolución de picos inesperadamente altos.